这篇文章是由埃默里大学定制克隆核心的负责人Oskar Laur贡献的保罗Colombi他是Addgene公司的产品开发科学家。
克隆是一个相当艰难的过程。PCR可能不能产生产物，转化可能不会导致任何细胞，或者所有筛选的菌落可能不包含正确的质粒。有很多地方可能会出错!除了克隆过程中的所有步骤外，还有许多方法可以对克隆实验进行故障排除。这里有一些技巧，将帮助您的克隆项目，并希望获得您梦寐以求的质粒没有实质性的延误。
设计、设计、设计
在进入实验工作之前，花一些时间概述质粒的构建和所有你需要采取的步骤。决定这技术你打算收养(也就是……限制克隆，吉布森组装，金门等等)，并尝试找到最简单的方法(例如，如果可能的话，避免一次组装太多的片段)。有很多软件可以在这个阶段帮助你，可以用来模拟在网上克隆。这肯定有助于理解你的策略是否会成功，并避免可能影响或延迟你的实验工作的简单错误。
片段一代
设计好克隆方案之后，就可以生成片段了。你可以根据你的克隆策略，以不同的方式组合出你想要组装的DNA部分:
限制性内切酶消化
注意你选择的限制性内切酶。米确保你使用的酶不会被XbaI, cli等甲基化所阻断。如果要进行多次消化，要确保不同酶之间的缓冲液和温度是兼容的。经常检查你消化的碎片大小琼脂糖凝胶．如果消化没有提供你期望的大小的片段，检查你选择的酶的限制模式，并验证你正在处理的质粒的序列是正确的。最好使用1-2 ug的载体进行消化。
聚合酶链反应
设计与模板重叠至少24 bp的引物，如果序列GC或at含量高，则将引物重叠区域增加到40-60 bp。对引物进行优化总是一个好主意，特别是当你在扩增目标序列时有困难时，或者如果你想从一个大的生物体基因组(如老鼠或人类)中扩增序列时。有几个在线工具可以帮助你做到这一点，它们可以是开源的。primer3)或由销售PCR试剂的大公司提供。
现在商业聚合酶是非常有效的，但如果你在扩增一个模板有困难，特别是从一个大的基因组，你可以重新检查你的引物设计或优化你的引物或PCR条件。
净化DNA片段
一旦你产生了你的DNA片段，从凝胶中净化你的消化片段或PCR产物总是一个好习惯。你要避免其他DNA片段的污染，你要去除在前面的反应中使用的缓冲液。这将增加你成功克隆并最终更快的机会。记得量化DNA浓度通过凝胶或纳米液滴，根据其摩尔比组装碎片。
片段的组装
根据所遵循的克隆策略，有多种方法可以组装质粒的不同部分。虽然关于这一步的大多数故障排除必须是特定于策略的，但有一些通用参数可以调整:孵化温度和时间，以及DNA的数量。作为一个一般规则，尽量使用过量的插入比骨干质粒;起始点可以是摩尔比1:2(质粒:插入)，但这个参数必须根据所采用的策略和你运行的特定反应进行优化。
转换
变换几微升的结扎反应。以下是可能的结果:
- 没有殖民地。如果没有菌落，检查培养皿中的抗生素是否与质粒中存在的抗生素抗性标记相对应。你还应该确认你的菌株和功效主管细胞(当他们老了，他们失去能力)。如果以上所述都是正确的，那么您可能应该对您的实验设计进行第二次和更详细的检查。
- 满草坪的细胞。你盘子里的抗生素可能不管用。检查盘子!在他们身上涂上一层大肠杆菌已知菌株对抗生素敏感，如果菌株生长良好，可能是时候准备新的抗生素库存的新盘子了。
- 大殖民地周围有许多小殖民地。你可能把盘子放在保温箱里太久了。小的菌落被称为卫星菌落，当所有的抗生素都被使用后，它们就形成了。不要太担心，只要挑大的蚁群，你就安全了!
殖民地的筛选
取少量菌落(5-10个)，在含有相应抗生素的小培养体积(2或3 ml)中培养，提取质粒，按以下步骤进行分析:
- 做一个单或双摘要，以确保质粒是正确的预期大小和包含正确的插入
- 对PCR扩增的区域进行测序，特别注意不同片段之间的连接区域
如果没有得到任何阳性克隆，尝试在不同菌株(stbl2, NEB stable等)中转化结扎混合物，并/或使用不同的温度(30℃)在平板和液体培养中生长。如果在这些步骤之后没有得到任何正面的克隆，您可能需要重新考虑您的方法，并尝试不同的方法克隆策略．
一旦你在筛选后确定了潜在的克隆，对质粒进行测序。许多载体含有与标准测序引物互补的序列。如果没有，设计引物来排列插入。当你得到你的测序结果时，你可以使用色谱来发现你的测序结果和预期结果之间的任何差异是由于PCR错误还是DNA分析软件的错误。
现在，您已经阅读了我们的质粒故障排除指南，希望您有一些新的策略来处理棘手的克隆项目。祝你的实验顺利!
非常感谢来自埃默里大学的客座博主奥斯卡·劳。
奥斯卡·劳尔博士自2009年开始经营埃默里大学DNA定制克隆服务。他开发了一种专有的、低成本的克隆协议，用于克隆超过10,000个DNA定制结构。他的研究成果在包括《细胞》、《自然》和其他期刊在内的数百篇出版物中得到认可。
Paolo Colombi目前是Addgene公司的产品开发科学家。在实验室里，他开发了新的化验方法和工艺。在实验室之外，他喜欢户外的所有可能的方面。
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
- 找到质粒克隆方案
- 阅读我们的分子生物学参考
- 找到分子生物学和实验室技术的指导视频
留下你的评论