用于微生物组研究的质粒工具

工程肠道微生物原位

虽然通过测序监测微生物组的能力是巨大的，但通过基因改变微生物组成员的能力是有限的，许多微生物很难在其自然环境之外培养。因此哈里斯王实验室在哥伦比亚大学开发了一种方法，可以从基因上改变原生栖息地的肠道微生物群成员（Ronda等人，2019年）。他们将他们的方法称为肠道微生物组的宏基因组改变我原位共轭（魔法）。

借助魔法，科学家们引入了一种大肠杆菌供体菌株进入微生物组，使用IncP将基因有效载荷传递给接受者⍺-家族-RP4结合系统。该系统可将质粒输送至革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞。

王实验室进一步开发了一套具有不同复制来源的质粒模块(pGT)，可用于广泛或狭窄范围的微生物物种。这些也包含了RP4转移原点以及一个可选择的标记和一个期望的遗传有效载荷(例如:GFP)。因此，细胞既可以用流式细胞仪分类，又可以用抗生素选择分离。

该团队测试了这个系统体外和体内．他们鉴定了来自四个门的19个属的细胞，这些细胞通过接合获得了质粒体内研究。然而，他们只确定了七个属体外实验，可能是因为体外条件没有最佳地支持各种物种的生长。这些结果进一步突出了需要的需求原位用于微生物组研究的遗传工具。

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基于纸的合成生物学方法分析肠道微生物群和宿主生物标记物

在临床和诊断实验室中，深度测序和qPCR方法成本太高且耗时，无法处理大量微生物组样本。为了对肠道微生物组进行大规模纵向研究，詹姆斯·柯林斯实验室发展出基于纸张的方法，可用于检测纸上的微生物和生物标志物．

他们方法的核心是RNA支点开关，一种RNA发夹，可以结合和检测几乎任何RNA序列。发夹的下游是一个核糖体结合位点(RBS)，随后是一个报告基因。发夹通过隔离RBS阻断转译，但结合“触发RNA”(在这种情况下，生物标志物RNA或16S rRNA从微生物群落中分离出来)揭示RBS并允许报告基因转译，从而产生GFP信号。随着标准品的加入，该分析是半定量的，可以近似样品中的mRNA浓度。

使用该系统，Collins实验室能够从10个具有临床意义的细菌和4个临床相关的宿主生物标志物中检测到mRNA。

实验室通过与qPCR的比较验证了他们的平台在临床粪便样本上的有效性，证明它也可以检测毒素mRNA的表达艰难梭菌．由于基于dna的qPCR方法无法鉴定mRNA的表达，因此能够检测毒素和其他感兴趣的转录本的mRNA转录本是该方法的优点。

在此处找到立足点开关微生物群/生物标记传感器

使用蜜蜂微生物组工具箱（BTK）研究蜜蜂微生物组

另一个缺乏遗传工具的系统是蜜蜂微生物组。得克萨斯大学奥斯汀分校的Nancy Moran和杰夫瑞巴里克实验室最近开发了蜜蜂微生物组工具包（BTK）研究大黄蜂和蜜蜂的微生物群。该工具包由模块化部件组成，这些部件与金门大会．

他们把工具箱建在酵母工具包通过将主链载体的高拷贝数细菌ColE1源替换为RSF1010来源，一个IncQ来源与广泛的主机范围（Meyer，2009年）。向量保留了奥立特通过接合的方式传递给接受者。

实验室筛选了质粒的宿主范围以及各种抗生素抗性标记物、启动子和可诱导基因表达系统在蜜蜂肠道微生物种群中的适用性，如阿尔维斯诺格拉斯菌和尖鳃亚藻．质粒还可以转化为不同蜂种分离的α proteobacteria、β proteobacteria和Gammaproteobacteria。

BTK可以在不固定或制备的情况下引入荧光标记，可视化肠道细菌的定位和分布，并传递CRISPR成分进行基因破坏或CRISPRi。这些广宿主范围质粒在设计用于研究蜜蜂菌群的同时，也可用于研究其他菌群系统。

查找用于广泛宿主范围质粒模块化组装的工具包

计数肠道菌群中的细胞分裂

监测肠道内的微生物种群动态可以深入了解微生物组对感染、失调和抗生素治疗的反应。为了促进这些研究，帕梅拉银的实验室开发了一种合成标记和重新捕获策略用于统计细胞分裂的细菌。该技术，称为分布式细胞分裂计数（DCDC）它依赖于荧光蛋白组装成一个明亮的粒子，并在细胞分裂时分离金宝搏app下载到一个细胞中。

为了实现荧光蛋白在细胞内凝聚成一个颗粒，实验室将红色荧光蛋白（R金宝搏app下载FP）与自组装蛋白（SAP）融合，如噬菌体外壳蛋白或细菌微区蛋白。这种融合的表达受阿拉伯糖诱导启动子的控制。

首先用阿拉伯糖诱导细胞开始表达SAP-RFP融合。然后，细胞被清洗以阻止新粒子的产生。在随后的细胞分裂中，含有该粒子的细胞比例随时间呈指数级下降，可以确定经过的代数。实验室用DCDC来测量生长速率E．大肠杆菌结果表明，该方法可用于这两种方法体外和体内研究。

在这里找到分布的细胞分裂计数质粒

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参考文献

Leonard, Sean P，等人。“利用广泛宿主范围质粒模块化组装工具箱的蜜蜂肠道微生物菌群遗传工程”合成生物学7.5(2018): 1279 - 1290。PubMedPMID: 29608282. 公共医学中心PMCID:PMC5963681．

迈耶，理查德。“广泛宿主范围IncQ质粒的复制和结合动员。”质粒62.2 (2009): 57-70. PubMedPMID:19465049. 公共医学中心PMCID: PMC2752045．

Myhrvold, Cameron等人。“一个分布式细胞分裂计数器揭示了肠道微生物群的生长动态。”自然传播6(2015): 10039。PubMedPMID:26615910. 公共医学中心PMCID:pmc466777．

Ronda, Carlotta等。《哺乳动物原位肠道微生物群的宏基因组工程》自然方法16.2(2019): 167。PubMedPMID:30643213. 公共医学中心PMCID:PMC6467691．

Melissa K.Takahashi等人，“用于分析肠道微生物群和宿主生物标记物的低成本纸质合成生物学平台。”自然传播9.1 (2018): 3347. PubMedPMID:30131493. 公共医学中心PMCID: PMC6104080．

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