这篇文章是我们正在进行的质粒101系列的一部分。质粒101将为您提供一般分子生物学知识和技术的概述。如果你有兴趣多读一些，你可以找到剩下的质粒101在这里．
现在我们已经讲过了抗生素的选择在质粒101，我们可以讨论一种更具体的筛选克隆反应的方法。在克隆时，能够选择包含质粒的菌落是一个很好的开始，但是如果能够选择那些包含有插入质粒的菌落呢?蓝白相间的选择是一种被广泛使用的方法!(要了解其他筛选策略，请查看我们的筛选概述博客文章．)
*注:在Addgene中有两种常用的蓝白斑筛选载体:pUC18和pUC19
让我们从头开始。良好的细菌虫胶操纵子包含一种叫做lacZ它编码了β-半乳糖苷酶。的表达虫胶操纵子是由乳糖和乳糖类似物IPTG(异丙基β- d -1-硫代半乳糖苷)诱导的。(完全准确地说，IPTG结合和失活虫胶操纵子阻遏因子，从而允许虫胶表达式)。
当表达时，β-半乳糖苷酶可以分解称为x-gal的染料连接底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β- d -半乳糖-吡喃糖苷)转化为半乳糖和一种不溶性蓝色色素(4-氯-3-溴靛蓝)。到目前为止，一切顺利，但这如何帮助我们筛选质粒呢?
实验室里的蓝白筛选
科学家们发现，从lacZ基因(名为lacZΔM15的突变)产生了一种无功能的β-半乳糖苷酶。向lacZΔM15-mutant细菌细胞提供编码这部分氨基酸(称为α肽)的DNA在反式对突变进行补充，允许产生功能性酶。这个过程称为α-互补。
该系统以以下方式实现了实际应用。科学家们将一个多克隆位点(MCS)植入α肽(左图中的橙色楔形)，并将其插入质粒中，创造了一个α互补克隆载体。当克隆反应开始时，你的DNA(红色)被克隆到MCS中，α肽被中断，如细胞a所示，因此不会补充细胞的β-半乳糖苷酶突变。一个不成功的克隆反应保持α肽完整，因此细胞将通过α-补体(细胞B)具有功能的β-半乳糖苷酶。
如右图所示，带有插入质粒的菌落具有无功能的β-半乳糖苷酶，并保持标准的可爱的白奶油色大肠杆菌．另一方面，完整的β-半乳糖酶从x-gal(包含在转化板培养基中)产生色素，使菌落变成蓝色。我们应该注意到，IPTG也包含在培养基中，以确保转录虫胶操纵子。
关于蓝白镜头的提示
- 使用良好的控制:转换骨干质粒而不插入。这个底片上的所有菌落都应该是蓝色的，表明你的IPTG和x-gal正在正常工作。
- 不要操之过急:重要的是要给你的盘子足够的时间来表达任何完整的β-半乳糖苷酶，并将x-gal加工成蓝色色素(16-20小时)。只有白色殖民地的盘子是非常可疑的!
- 冷藏板块:在第一次过夜孵育后，将培养皿放置在4C下数小时，可增加色素沉淀，增强阴性菌落的蓝色，并可更好地区分蓝色和白色菌落。
- 做盘子时要小心:X-gal对光和温度敏感，需要在高压灭菌后添加到介质中。如果铺在预先制作好的板材上，请确保均匀分布，并在使用前留出足够的干燥时间。
- 小心假阳性:蓝白扫描仅表明存在a插入，而不一定是您的插入。任何破坏α肽DNA的克隆产物也会导致一个白色菌落。
- 还有假阴性:这种情况很少见，但如果在镜框中插入一个小片段，通读可以导致功能性β-半乳糖苷酶和蓝色菌落。蓝白筛选是一种很好的方法来缩小更具体分析的候选者，如PCR或限制性消化。
蓝白屏就是这样- - - - - -一个筛选过程。它并不只选择那些已经获得质粒的细胞，因此应该与选择方法一起使用。结合选择和筛选，可以确保你所看到的白色菌落是由于成功克隆而不是因为细胞没有获得α互补质粒而变成白色的。通过这种方法，你可以快速和轻松地识别菌落，不仅有你的质粒(抗生素耐药性)，而且也确认这些质粒有你的插入(蓝白筛选)。
其他类型的筛选方法
虽然蓝白筛选可能是选择含有插入物的质粒最广泛的方法，但还有其他方法。阳性选择载体编码一个基因，当表达时，对细胞是致命的。克隆片段被插入到该基因中心的MCS中，破坏了致死率。这类似于在蓝白色屏幕上的α-肽DNA破坏。抗生素选择也与这种方法结合使用，以确保阳性菌落确实含有致命基因的质粒。一个例子是ccdB基因系统常用在网关®克隆．
也有不使用抗生素耐药性筛选含质粒细胞的方法。这些依赖于对某些培养基成分敏感或依赖的细胞系，并由转化质粒上提供的基因拯救。这种质粒可能含有基因，允许在特定的培养基中使用特定的底物，否则细胞无法繁殖形成菌落(用于补充营养缺陷细胞系)，或挽救致命表型的基因。
参考资料在Addgene博客188博金宝官网
- 阅读我们的帖子常见的实验室大肠杆菌菌株
- 学习使用酵母双杂交系统
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