如果您喜欢克隆，那么您可能知道目前有几种方法可以用于处理克隆。这些包括传统的限制性内切酶/连接酶介导法，最近开发的吉布森组装克隆和Gateway®克隆技术，以及其他几种技术。每种方法都是独特的，并且依赖于对克隆反应起关键作用的特定成分。了解特定成分对于为自己的实验选择正确的克隆方法至关重要。在这里，我们将重点关注一种独特的基因，该基因构成了流行的网关商标方法:建行.但是什么是建行，它在现代克隆中扮演什么角色，为什么你应该了解更多有关它的知识?继续读下去，看看是怎么做到的建行可以让你的克隆实验更容易一点。
传统克隆最耗时的一个方面是识别实际上包含您感兴趣的插入内容的克隆。简单地说，建行通过对不占用插入空间的向量进行选择，使克隆变得更容易。但具体如何选择建行做到这一点的?让我们从基因的简史以及分子生物学家如何利用它来进化克隆技术开始。
CcdB：一种强效毒素。。。
这个建行基因，位于F性因子质粒上E大肠杆菌是由CCD操纵子编码的毒素-抗毒素系统的一部分，负责在细胞分裂期间维持质粒。建行有毒蛋白质（CcdB）的代码，作为DNA旋转酶毒素，用断裂的双链DNA锁定DNA旋转酶，最终导致细胞死亡。中央数据局，是在ccd操纵子中发现的另一个基因，它编码抗毒素蛋白(CcdA)，可以保护细胞免受毒性CcdB的侵害。细胞失去中央数据局通过F质粒的损失，屈服于CcdB的毒性。
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图1:Bernard，P.等人的图像显示了pKIL 18/19载体，并证明了限制性内切酶介导的ccdB破坏的概念，从而对所需克隆进行了阳性鉴定。 |
．..成为强大的克隆工具
大约20年前，分子生物学家第一次看到这个系统在提高克隆效率方面的潜力，并开发了克隆载体来利用它。这些载体称为pKIL18和pKIL19，包含建行带MCS的框架中的基因。大肠杆菌用空载体转化的表达建行基因，因此无法繁殖，因为CcdA无法中和毒素。然而，如果研究人员成功地将一个插入物克隆到载体中，那么建行阅读框将被破坏，使表达重组质粒的细胞得以繁殖。任何含有非重组载体（例如重新连接的空载体）的细胞仍将表达重组质粒建行因此会死亡。这一过程大大减少了不含重组质粒的克隆数量，因此使克隆过程更加高效，因为人们不必彻底筛选插入的菌落。
Gateway®技术（由体外激素商标)本质上是这个旧系统的一个更现代的版本，它增加了一些优点，我们将在另一篇文章中详细讨论。专注于建行在这方面，Gateway利用了细胞在表达基因时不会繁殖的相同原理建行。成功插入将完全替换建行加上调查员的兴趣因此，可以更有效地识别正确的克隆，因为不包含所需插入的克隆不应该生长。
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图2:来自http://teachline.ls.huji.ac.il/72682/tutorials/gateway/introduction.html演示了研究者感兴趣的基因“交换”ccdB背后的原理。 |
抗CcdB大肠杆菌张力使系统完整
但是建行单细胞并不是这个系统的唯一关键——一个人如何处理杀死表达它的细胞的质粒/基因？答案在于特殊的基因株大肠杆菌能够耐受毒素基因的表达。其中一种是DB3.1，其中含有一种突变型DNA回旋酶（gyrA462），该酶对CcdB的毒性作用具有抗性ccdB生存™从表达载体商标．使用DB3.1或ccdB生存商标，可以有效地繁殖和制备含有建行基因，然后可用于下游克隆应用。虽然这两种菌株最终执行相同的功能，但有一些证据表明，ccdB Survival™可能更难以转化，这取决于所使用的特定质粒。
我们还想指出，虽然DB3.1和ccdB幸存菌株是专门针对含ccdB的载体开发的，但任何含有F质粒(F’菌株)的质粒也将对ccdB具有耐药性，因为原生的ccdA将存在。最常见的克隆菌株大肠杆菌不含F质粒(被认为是F-);然而，有一些流行的实验室菌株，如NEB Stable, JM109, XL1 Blue或XL10 Gold，是F '。这些菌株可能被用来繁殖和准备你的含ccdb的空骨干，但绝不应在选择重组质粒时使用。查看我们的博客实验室常见大肠杆菌菌株获取更多的应变信息。
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参考文献
1.用CcdB对重组DNA的阳性选择。生物学技术。1996年8月,21(2):320 - 3。PubMedPMID:8862819．
2.Bahassi，EM.等人，“F质粒CcdB杀伤蛋白：编码保留其调节功能的非细胞毒性蛋白的CcdB基因突变体”，《摩尔微生物学》，1995年3月；15（6）：1031-7。PubMed采购经理人指数：7623659．
3.使用F质粒ccdB杀手基因的阳性选择载体”。中国科学(d辑:地球科学)1994 10月11日;148(1):71-4。PubMed采购经理人指数：7926841．
4.F质粒CcdB蛋白通过旋回酶诱导atp依赖的DNA裂解。中华医学杂志。1993年12月5日;234(3):534-41。PubMedPMID:8254658．
5.F质粒CcdB蛋白杀死细胞涉及DNA拓扑异构酶II复合物中毒，《摩尔生物学杂志》。1992年8月5日；226(3):735-45. PubMedPMID:1324324．
6.Tam，JE.和Kline，BC.“质粒F中ccd操纵子的控制”，《细菌学报》，1989年5月；171（5）：2353-60.PubMed采购经理人指数：2651399公共医疗中心PMCID:PMC209908
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