分子克隆需要一些菌落筛选法对于插入的存在。传统上是这样做的限制性内切酶消化;然而，菌落PCR可以用更少的时间和更少的钱完成同样的事情。菌落PCR的关键步骤是:1)设计引物检测插入物的存在;2)建立标准PCR反应n (primer, dNTPs, polymerase)，以裂解菌上清液为模板;和3)在凝胶上进行聚合酶链反应分析产品大小．这篇博文讨论了在进行菌落PCR时需要考虑的一些关键问题。
菌落PCR引物设计
菌落PCR的第一步，也许也是最重要的一步是设计引物．引物设计有3种策略:1)插入特异性引物，2)骨干特异性引物，3)定向特异性引物。
插入特定引物:插入特异性引物被设计为退火到插入特异性序列。这是一种“是或否”的测试，阳性克隆会放大产品，阴性克隆则不会产生产品。此外，这种类型的引物只告诉你特定的插入物是否存在，但不告诉你它是否在正确的方向，甚至是否在你的质粒骨干中。
Backbone-specific引物:第二种选择是设计骨干特异性引物。这些引物的设计是为了退火到插入位置的侧面。在没有插入的情况下，阳性克隆将比阴性克隆生产更大尺寸的产品。这种类型的引物对可以告诉你插入物的大小是否正确，它是否在你的脊柱内。这种类型的引物对对于筛选具有相同主干但包含不同插入的克隆也很有用。当你设计引物在克隆位点外退火时，插入序列是什么并不重要，允许你使用相同的引物对来筛选许多不同插入物的存在。缺点:这种类型的底漆不能提供关于插入方向的信息。
Orientation-specific引物:如果需要关于插入方向的信息，那么可以考虑设计特定于方向的引物。钝端克隆是您可能想知道插入方向的一个例子。这种类型的引物对的一个成员退火到插入的侧翼序列，一个引物退火到插入。创建这种类型的引物对的一个简单方法是混合和匹配插入特异性引物和脊骨特异性引物。
每一种方法都有其优点和缺点，如下表所述。你使用的引物类型取决于你的喜好。无论哪种方法，在使用菌落PCR引物筛选菌落之前，确保测试你的菌落PCR引物。最好的方法是使用带有或不带有插入物的载体来验证引物是否能扩增预期大小的PCR产物。
| 引物设计 | 优点 | 缺点 |
| 插入特定 |
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| Backbone-Specific |
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或ientation-Specific |
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PCR设置
建立殖民地PCR反应与制备标准PCR反应几乎相同:将模板、引物、聚合酶和dNTPs结合，然后用标准PCR热循环程序孵育。一个关键的区别是，质粒DNA必须从细菌中释放出来才能作为PCR模板。处理这一点和一些其他菌落PCR提示突出如下。
准备模板:用无菌扁平牙签或移液管尖挑出单个菌落，在少量无菌水中旋转。总共选择3-10个菌落进行测试，取决于你的无结扎控制板上的背景菌落数量。背景越多，你需要筛选的殖民地就越多。
为以后的培养保存克隆体此时，您将希望保留您的克隆版本以供以后使用。有几种方法可以做到这一点。如果你打算在同一天完成你的菌落PCR分析，你可以保存剩下的细菌-水悬浮液，并使用它们开始培养你的阳性克隆。如果你想长期保存你的克隆体，只要在磅板．你可以用这个盘子开始液体培养。最后，你可以用你挑选的克隆体开始小的隔夜液体培养，只对阳性的进行小的准备。无论您选择哪种方法，请确保使用合适的方法抗生素的选择．
裂解细菌，建立PCR反应:剩余的细菌-水悬浮液将作为你的PCR反应的模板。你只需要溶解细菌以释放质粒DNA，要么在使用前将样本简单煮沸，要么直接将一小部分样本加入PCR反应。在PCR反应的初始加热步骤中，细菌将被裂解。一个标准的Taq聚合酶就足够了。
控制:控制可以决定实验的成败．菌落聚合酶链反应的最佳对照与验证菌落聚合酶链反应引物是否起作用的对照相同:有插入物和没有插入物的主链载体。当你在凝胶上运行PCR产物时，这些控制是你可以使用的快速参考，以确定菌落是否包含插入物。它们也可以作为PCR反应的对照。运行无模板控制PCR反应检测污染也是一个好主意。
在凝胶上分析PCR产物大小
现在PCR已经完成，是时候在琼脂糖凝胶上运行产品来确定它们的大小了。确保使用一个适当的分子量标准作为参考，并在将样品移液到凝胶上之前添加甘油负载染料。上图总结了上述三种引物的总体预期结果。当使用插入特异性引物(1)时，阳性克隆(+)会有条带，而阴性克隆(-)则不会。与阴性克隆相比，骨干特异性引物(2)对阳性克隆(+)具有更大的产品尺寸。最后，定向特异性引物(3)给出与插入特异性引物相同的带(+)或无带(-)结果，但也告诉你插入物的方向性是否正确。
用Sanger测序验证插入顺序
在鉴定出几个阳性克隆后，最后一步就是mini-prep然后将质粒提交给桑格测序。测序允许您确认插入的序列，插入的方向，以及质粒和插入DNA之间的连接序列。菌落聚合酶链反应将大大减少你需要送去测序的克隆数量，但不会告诉你你的产品是否有任何突变。
有很多不同的克隆策略，但不管你最喜欢哪一种，菌落PCR都是你分子生物学工具包中有用的工具。下次你在筛选阳性克隆的时候不妨尝试一下!
长凳上的技巧和技巧
不要选择太大的群体。太多的细菌会抑制你的PCR反应或导致非特定产品出现在你的凝胶上。
小心假阳性。仅仅因为你得到了预期大小的PCR产物并不意味着在你的插入物中没有突变。在继续你的实验之前，请确保提交多个阳性克隆进行测序，以验证插入序列。
扩增子越短越好。较短的扩增子导致较短的PCR程序，更有可能在含有细菌碎片的PCR反应中发挥作用。
使用积极的控制。用相同的主链质粒转化细菌是良好的阳性对照。如果这个对照没有扩增产物，那么你就知道PCR设置和/或引物设计可能有问题。
使用阴性对照菌株．良好的阴性对照菌株是用于克隆的同一菌株的未转化培养物。这种类型的控制对于插入特异性引物尤其重要。如果你的阴性对照放大了预期大小的产物，你就知道你的细菌基因组已经包含了你的目标序列。
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