质粒101:控制质粒

科学家们每天都要进行许多不同类型的实验。尽管设计和结果可能会有所不同，但在每一项基于实验的假设调查中都应该有一件事：适当的控制！

对于每一个实验，研究者都需要一个标准来比较结果；缺乏适当控制的实验结果总是不确定和不可靠的。适当的控制提供恒定变量，使您能够正确解释正在测试的自变量的影响。重要的是，它们展示了实验系统的功能，并有助于确定在实验中进行故障排除或优化的机会。继续读下去，了解更多用于质粒实验的各种控制方法。

什么是控制质粒?

一般来说，控制质粒有助于确保你的实验中观察到的现象是与你正在测试的自变量专门相关的，而不是一些其他意想不到的因素。控制质粒被用来最小化任何非自变量的影响。

为了说明控制质粒的重要性，我们将超越抽象讨论的范围，以基于质粒的实验为例，描述其必需的控制质粒，并讨论为什么这些控制质粒对于正确设计实验至关重要。

试验:基因X表达的敲除成分由质粒表达的

图1:X基因表达水平

上述结果来自于将质粒a(编码针对人Y骨干基因X的shRNA)转染到人细胞的单个实验。

从这个结果我们可以简单地得出结论，shRNA不起作用，因为质粒A处理的细胞中X基因的表达水平与未处理细胞中X基因的表达水平相似，但我们能确定吗？我们知道质粒是否成功进入细胞？shRNA靶点正确吗？纯化的质粒DNA是否可行？还是细胞毒性？事情是如何以及在哪里出错的？使用适当的控制质粒可以解决和回答这些问题。

控制质粒的类型

实验计划的一部分包括确定需要控制哪些因素，以消除对结果的任何替代解释。通常，基于质粒的实验采用转染、阴性、阳性和复制对照。

转染对照：空载体和内部对照

转染控制测量转染效率，并能够观察转染本身（即，转染中使用的载体、转染试剂或转染过程）可能对靶细胞产生的任何影响。一个转染对照是空向量控制具体来说，质粒没有自变量。回顾与图1相关的实验，自变量是shRNA。因此，空对照载体应为质粒A sans shRNA，或仅为骨架Y。空载体控制允许您检查转染试剂或转染过程本身是否对靶细胞有任何细胞毒性作用。

另一种类型的转染控制是内控载体，它测量转染效率。内部控制可能是构成性地表达报告蛋白的质粒(例如，绿色荧光蛋白或荧光素酶)，要么与测试质粒共转染，要么转染到你细胞的一个单独的孔中。无论如何，报告蛋白活性的数量与转入细胞的DNA数量和细胞表达该蛋白的能力有关。

在图1的结果分析中，内部对照，如表达gfp的质粒B，可以证明细胞是否成功转染并表达了蛋白。例如，我们的实验得到的荧光显微镜图像，包括前面提到的内部控制，并与图1的结果一致，如图1所示:

图2质粒B的表达(内对照)

这一结果表明，由于活细胞缺乏GFP荧光，因此转染不成功。这个结果为转染试剂和过程的故障排除和优化提供了机会。值得注意的是，最佳的实验条件，包括使用多少质粒DNA进行单个或共转染，应该由经验来确定。

阴性对照：未处理细胞、空载体对照和非靶向对照

阴性对照条件和质粒应产生零效应(即没有观察到任何现象)。在任何以质粒为基础的实验中，都应该包括未处理的细胞，因为这些细胞提供了基线/标准，可以与其他样品进行比较。

空病媒控制(上面提到的)也可以作为一个重要的阴性控制。在这种情况下，空载体控制显示载体/骨干本身对目标细胞中的基因表达的任何影响。

在使用基因靶向或基因组编辑技术（如RNAi或CRISPR）的实验中，非靶向控制可能是合适的，因为它们允许您评估观察结果的特异性。非目标对照是产生类似产物的阴性对照，但不针对实验细胞内的内源性基因。例如，在上面的实验中，质粒A含有靶向人类基因X的shRNA，并且正在转染人类细胞。在这个实验中，一个合适的非靶向控制可能是一个shrna -与质粒A具有相同的主干，不靶向任何哺乳动物基因。这种非靶向控制对于正确解释结果是至关重要的，因为它在分析针对人类基因x的shRNA的特异性时提供了一个重要的参考点。非靶向控制还评估了shRNA一般引入目标细胞的任何影响。

积极的控制

阳性对照质粒应产生预期的现象。正面控制的一个例子，内部控制载体，已在前面描述。一旦你确定你的条件有助于质粒DNA成功导入细胞，内控载体就可以作为转染的阳性对照，因为它产生预期的效果，即绿色荧光细胞（图3）。

图3：质粒B的表达（作为阳性对照）

其他阳性对照是本实验特有的，应相应设计．如果你试图激活一个基因，你应该设计一个显示最大激活的对照。同样地，如果你试图抑制一个基因，你的控制可能是一个系统，该基因的表达被完全敲除。根据实验需要，这些控制可能是基于质粒的，也可能不是。以我们的实验为例，在质粒A中针对人X基因的shRNA的预期结果是X基因的表达降低，因此阳性对照应降低X基因的表达。

由于对照质粒的关键特征是最小化实验中非自变量的影响，因此阳性对照质粒的设计和选择应高度针对实验和自变量的询问。

复制控制:技术和生物控制

可靠的结果可从适当的对照实验中重现。观察到的与自变量相关的表型应随着时间的推移和表达自变量的纯化的测试质粒的不同制备而一致。复制控制有两种:技术控制和生物控制。

一般来说，技术复制可被认为是“底片控制”。．他们不是独立的通常都来自于一个来源。相反,生物复制独立且可以被认为是“重现性控制”。生物复制是构成你的样本量(也就是你的N并且应该来自多个独立的来源。我们将在下面详细描述这些内容，但参考文献部分引用的论文提供了更深入的信息。

技术复制

技术控制的一个例子是在同一个板内用来自同一分配剂/制剂的纯化质粒转染多个分离孔。复制控制不是测量或评估再现性的独立变量的影响由于纯化质粒,细胞,和媒体中使用的每个井并不是独立的,他们来自相同的源和孵化在相同的板在同一时间。虽然复制控制是重要的，但它说明了试剂和进行实验的手的一致性，而不是观察到的与自变量相关的表型的重现性或一致性。

生物复制

在任何一组实验中，生物控制都更耗时，最终也更重要。理想情况下，每次生物复制都应该使用新鲜的培养基，测试独立的细胞和质粒，在不同的日子进行，等等，但外部限制可能会施加一些限制，在解释你的结果时你应该认识到这些。生物控制的关键是独立性:至少你应该在不同的日子，从开始到结束重复你的整个实验多次。使用上面的例子，我们将在不同的天数内，在不同等量的细胞中测试不同的质粒A的制备。生物复制控制与自变量相关的观察表型的再现性和一致性，有助于确保表型不是单一的或只与测试质粒的一次分配/制备有关。

现在让我们重新审视我们的实验。在图1中，似乎shRNA并没有敲除X基因的表达，但如图2所示，这可能是由于原始转染条件。现在我们已经成功转染了我们的细胞(图3)，我们可以继续我们的实验，加入额外的阳性和阴性对照，进行多次重复，最终得到可解释的结果:

图4:X基因的表达水平

设计和选择适当的实验控制不是一件容易的事，因为生物系统有许多变量。无论这些步骤的设计和执行是多么艰巨，适当的控制是负责任的科学调查和调查的基本原则。

参考资料：

1.神经科学研究中的伪复制问题:它会影响你的分析吗?Lazic SE。BMC >。1月14日,十一5。（2010) PubMedPMID:20074371．公共医学中心PMCID:PMC2817684．

2.复制和重复有什么区别，有什么意义？沃克斯，等EMBO代表．4月;13(4): 291 - 296。（2012). 公共医学中心PMCID: PMC3321166．

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