质粒101:Cre-lox

在我们的质粒101系列之前的文章中，我们检查了一些重要的质粒元素-启动子，起源的复制，蛋白质标记,抗生素抗性基因(仅举几例)。在这个版本中，我们将会看到一个非常有趣的工具cre在转基因动物、胚胎干细胞和/或组织特异性细胞类型中特异性、靶向的DNA修饰(请原谅双关语):Cre-lox重组．

Cre-lox是什么?

creo -lox体系是一种可用于诱导位点特异性重组事件的技术。该系统由来自P1噬菌体的两部分组成:Cre重组酶和loxP识别位点。P1噬菌体使用这些组成部分作为其自然病毒生命周期的一部分，研究人员已经将这些组成部分用于基因组操作。

Cre重组酶，最初命名为c条款再保险组合”(虽然后来被称为“cyclization再保险是一个38kda蛋白，负责loxP识别位点的分子内和分子间重组。该系统的一个关键优势是Cre独立于任何其他辅助蛋白或辅助因子，因此允许在各种实验中广泛应用。

LoxP (l调焦ofX(交叉)有关P1)位点是34个碱基对长识别序列，由两个13 bp长回文重复序列组成，由一个8 bp长不对称核心间隔序列隔开。核心序列的不对称性使得loxP位点具有方向性，而t规范的loxP序列为ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。除了P1噬菌体，loxP序列不会在任何已知基因组中自然发生，而且它足够长，几乎不可能随机发生。因此，在DNA序列中有意的位置插入loxP位点可以进行非常具体的操作，如下所述。

它是如何工作的?

如上所述，Cre重组酶催化两个loxP位点之间的位点特异性重组事件，loxP位点可以位于同一DNA片段上，也可以位于不同的DNA片段上。在一个loxP位点上的两个13bp重复序列都被aCre蛋白质，形成二聚体。然后两个loxP位点以平行方向排列，允许四个Cre蛋白形成一个四聚体。双链DNA断裂发生在每个loxP位点的核心间隔内，并将两条链连接在一起，导致相互交叉事件。

根据loxP站点的位置和方向，该事件可以有三种一般结果:

反演:如果loxP位点在相同的DNA链上并且方向相反，重组就会导致DNA的反转和区域loxP站点之间的关系被逆转。

删除:如果位点朝向相同的方向，loxP位点之间的序列将被作为一个环状DNA片段切除(不保留)。

易位:如果位点在单独的DNA分子上，则在loxP位点上产生易位事件。

我怎么用克鲁油?

Cre/lox系统是一个成熟的研究工具，特别是在小鼠转基因领域。下面列出了一些最常见的用法。

• Cre-dependent基因表达-在感兴趣基因的上游两侧放置一个loxP位点的终止密码子(通常称为“lox-stop-lox”或“LSL”盒)将在没有Cre的情况下阻止基因表达。在Cre存在时，终止密码子被切除，基因表达继续进行。泰勒·杰克的实验室里有一种很受欢迎的熏鲑鱼质粒:Lox-Stop-Lox威尼斯平底渔船．
  
  
• Cre-dependent基因敲除-相反，把loxP位点放在基因的两边(称为“floxing”，意思是“浮动”)。f瘦的,液态氧P”)，将允许基因表达，直到Cre存在，此时基因将被中断或删除。
  
  
• 选择标记删除-在传统的小鼠定位中，使用抗性标记选择目标克隆;然而，通常需要在最初的选择过程之后去除标记。通过浮动选择标记，Cre可以很容易地执行驱逐。
  
  
• 监管Cre表达式-将Cre置于启动子的下游，启动子只在特定的细胞或组织类型中有活性，在发展的特定阶段，或通过使Cre诱导(如与他莫昔芬或多西环素)，Cre重组酶只能在特定的细胞或特定的时间表达。将这种方法与上面描述的一些loxP方法结合起来，可以根据实验限制来限制基因修饰。这已被用于广泛的目的，包括激活一个特定器官的致癌基因，或绕过胚胎的致死率。
  
  

为了便于crex -lox技术的使用，我们已经构建了在各种普遍存在和调控的启动子下表达Cre的转基因小鼠，并且还构建了许多包含loxp的等位基因。此外，含cre腺病毒(Ad-Cre)或AAV (AAV-pgk-Cre)已成功地将Cre引入感兴趣的细胞中。

如果我需要两个单独的重组事件呢?

使用loxP站点的一个潜在限制是，如果存在两个以上的loxP站点，无法严格控制哪些loxP站点重新组合;分子内事件发生的频率大于分子间事件，但任何两个位点都有可能重组。为了解释这一点，已经创建了loxP位点的替代突变版本，其中包含一个独特的不对称间隔。nnnannn”，其中“N”表示哪些碱基可能与规范序列不同．其中包括loxN (GtATACcT)、lox2272 (GgATACtT))和lox511 (GtATACAT)。这些变异的lox位点与同类型的其他位点进行重组，但不是交叉兼容的。使用不同的lox位点变体可以使Cre在单一系统中催化不止一个特定的重组事件。

Saccharomyces cerevisiae Flp -FRT重组系统是另一种在概念上非常类似creo -lox的位点定向重组技术，flippase (Flp)和short flippase recognition target (FRT)位点分别与Cre和loxP相似。FLP-FRT技术可以作为creo -lox的一种有效替代品，并且也被与之结合使用，从而可以同时控制两个单独的重组事件。

你在研究中使用过creo -lox系统吗?你有什么技巧或技巧吗?请在评论中告诉我们!

参考文献

1.噬菌体P1位点特异性重组。I. loxP位点之间的重组。斯腾伯格，N.和汉密尔顿，D. 1981。PubMedPMID:6276558．

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3.T转基因小鼠的问题和位点特异性重组。欧尔班、崔、丁、马思1992。PubMedPMID: 1495975．公共医学中心PMCID:PMC49604．

4.通过cre - loxp介导的基因靶向，可以独立控制单个开关区域的免疫球蛋白开关重组。顾，H.，邹，Y.R.， Rajewsky, K. 1993。PubMedPMID: 8513499．

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