在之前的Plasmids 101博客中，我们回顾了几种流行的质粒菌株的显著特征大肠杆菌DNA传播．虽然这对克隆很有帮助，但是大肠杆菌菌株通常不适合重组蛋白的表达。当外源蛋白在大肠杆菌中过度表达时，可能会出现许多挑战大肠杆菌.我们将回顾重组蛋白表达的潜在缺陷以及一些最流行的商业菌株，旨在避免这些缺陷。
为什么我需要一个表达菌株?
蛋白表达的高仿质粒数量和有力的推动者将大大超过任何天然宿主蛋白质，耗尽细胞中的宝贵资源，从而导致生长放缓。此外，一些蛋白质产品在表达时可能对宿主有毒，特别是那些不溶性、作用于DNA或具有酶活性的蛋白质产品。因此，重组蛋白质通常在大肠杆菌利用诱导启动子系统(这将在后面讨论)来适应高蛋白质负荷。除了下面概述的基本基因型外，某些特殊菌株还可以提供更大的转录控制，帮助蛋白质正确折叠，并处理次优密码子使用（表1）
一些突变是所有或大多数表达菌株共同的，以适应高蛋白水平，包括:
- ompT：具有该突变的菌株外膜蛋白酶VII缺乏，这减少了表达的重组蛋白的蛋白水解。
- lon蛋白酶：完全删除(指定lon或Δlon)的菌株同样减少表达蛋白的蛋白水解。
- hsdSB(右B-MB-）：这些菌株有一个失活的固有限制/甲基化系统。这意味着该菌株既不能限制DNA也不能使其甲基化。
- dcm：同样，具有这种突变的菌株也不能在特定序列内甲基化胞嘧啶。
表1:大肠杆菌表达菌株
注：除**为K12外，所有菌株均来源于大肠杆菌B菌株
| 应变 | 电阻 | 主要特征 | 基因型 | 使用 |
| BL21 (DE3) | 含T7 RNAP (DE3)的碱性iptg诱导菌株 | F-ompT朗hsdsB(右B-MB-)加扩张型心肌病(DE3) |
一般的蛋白表达 | |
| BL21 (DE3) pLysS * | 氯霉素(pLysS) | pLysS表达T7溶菌酶降低基础表达水平;表达载体不能有p15A的复制原点 | F-ompT朗hsdsB(右B-MB-)加扩张型心肌病(DE3) pLysS(凸轮（R） |
毒性蛋白表达 |
| BL21 (DE3) pLysE * | 氯霉素(pLysE) | 与pLysS相比，pLysE的T7溶菌酶表达量更高;表达载体不能有p15A的复制原点 | F-ompT朗hsdsB(右B-MB-)加扩张型心肌病（DE3）pLysE（Cam）R) |
毒性蛋白表达 |
| 恒星BL21 (DE3) | 缺乏功能性RNaseE，导致较长的转录本半衰期 | F-ompT朗hsdsB(右B-MB-)gal dcm rne131(DE3) |
一般表达式;不推荐用于有毒蛋白质 | |
| BL21-A1 | 四环素 | T7 RNAP的阿拉伯诱导表达IPTG可能仍然需要表达 | F-ompT朗hsdsB(右B-MB-)gal-dcm-araB:: T7RNAP -春节A. |
一般的蛋白表达 |
| BLR (DE3) | 四环素 | RecA-deficient;最适合具有重复序列的质粒。 | F-ompT朗hsdsB(右B-MB-)加扩张型心肌病(DE3)Δ(srl-recA) 306:: Tn10(春节（R） |
不稳定蛋白的表达 |
| HMS174 (DE3) * * | 利福平 | RecA缺陷；允许在同一菌株中克隆和表达 | F-recA1 hsdR(右K12-MK12 +) (DE3) (Rif（R） |
不稳定蛋白的表达 |
| 调谐器(DE3) | 包含突变的紫胶透性，允许对表达进行线性控制 | F-ompT朗hsdsB(右B-MB-)gal-dcm-lacY1(DE3) |
毒性蛋白或不溶性蛋白的表达 | |
| Origami2 (DE3) * * | 链霉素和四环素 | 含活性高的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶，有利于适当折叠;可能增加多时间形成 | Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F′[lac+ lacIq pro] (DE3) gor522::Tn10 trxB (StrR, TetR) |
不溶性蛋白的表达 |
| Rosetta2（DE3）* | 氯霉素(pRARE) | 适用于“通用”翻译；包含7个额外的tRNA，用于罕见密码子，通常不用于大肠杆菌。E表达载体不能有p15A的复制原点 | F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR) | 真核蛋白表达 |
| Lemo21（DE3）* | 氯霉素(pLemo) | 鼠李糖可调T7RNAP表达减轻包涵体形成。E表达载体不能有p15A的复制原点 |
fhuA2[lon]ompT-gal（λDE3）[dcm]∆hsdS/pLemo（CamR） |
毒性、不溶性或膜蛋白的表达 |
| T7表达 | iptg诱导T7 RNAP基因的表达不会限制甲基化的DNA |
fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr-73::miniTn10—TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10—TetS) |
一般的蛋白表达 | |
| m15 pREP4*** | 卡那霉素（pREP4） | Cis-repression的大肠杆菌T5启动子（在pQE或pQE等载体上发现）类似的)，由IPTG(在pREP4质粒上的lac阻遏物)诱导。E表达载体不能有p15A的复制原点 | F-，Φ80ΔlacM15，thi，lac-，mtl-，recA+，KmR | 毒性蛋白表达 |
*表示存在额外的质粒——确保通过在适当的媒体上生长来保持这一点。注:不建议从这些菌株中纯化您的表达质粒，因为这些辅助质粒可能在制备过程中被分离出来。
诱导表达是如何工作的？
如上所述，许多表达质粒利用可诱导启动子，在向生长介质中添加诱导剂（如IPTG）之前，这些启动子处于“非活性”状态。诱导时间非常重要，因为您通常希望确保您的细胞首先达到适当的密度。处于指数生长阶段的细胞是活的和健康的，这使得它们是蛋白质表达的理想选择。如果你等待诱导时间过长，你的培养物将开始收集死亡细胞，相反，你不能过早诱导，因为培养物中没有足够的细胞来制造蛋白质。
DE3溶酶原/T7启动子组合是最流行的诱导系统。DE3溶酶原在lac阻遏物的控制下从细菌基因组表达T7 RNA聚合酶（RNAP），该阻遏物可通过添加IPTG诱导。T7 RNAP可用于从质粒上的T7启动子转录感兴趣的基因。如菌株名称所示，许多商业菌株携带DE3溶原。相反，其他菌株如M15（pREP4）使用lac阻遏子直接作用于表达质粒，以抑制来自杂交启动子的转录。
虽然DE3/T7 RNAP系统在大多数实验中工作良好，但lac启动子可能“泄漏”，这意味着即使没有添加IPTG，也存在低水平的表达。这主要是有毒蛋白质产品的问题，它会阻止培养物在合理的时间内达到所需的密度。在这些情况下，一些菌株携带额外的控制措施，如pLys质粒，抑制基础T7表达。pLys质粒含有阳性选择的氯霉素抗性盒和p15A复制原点，与其他p15A质粒不兼容。pLys有两种类型——plyss和pLys——不同之处在于后者提供了更严格的基础表达控制。
如果我没有看到蛋白质过度表达呢?
上述菌株在大多数情况下都应该产生足够的表达水平，但是当你尝试了一种普通菌株但没有得到所需的水平（或任何水平）时，你会怎么做蛋白质表达？低表达的结果可能来自多种来源，因此，有一些简单的故障排除措施可以帮助您回到正轨：
- 兼容性:仔细检查你的质粒主干和表达菌株，确保它们是兼容的。例如，阿拉伯糖诱导质粒不能在IPTG诱导株中表达，p15质粒也不能与pLys菌株兼容。你的菌株可能需要额外的抗生素选择或特殊的生长培养基，或者如果你的质粒是低拷贝的，考虑降低抗生素浓度。
- 增长Tempurature:通过设置一个小规模的表达式实验来测试变量，如温度、时间和介质条件，来分析表达式条件。许多重组蛋白在30°C或室温下表达更好，这是通过在37°C下培养到所需密度并降低温度或将其移到台式摇床10-20分钟后添加诱导剂来实现的。
- 生长介质：更换培养基很棘手，因为在生长速度和蛋白质质量之间可能存在权衡。对于许多蛋白质而言，富含培养基（如TB或2XYT）是最佳选择，因为它们支持高细胞密度；但是，如果蛋白质产物分泌到培养基中或如果表达缓慢，则最好使用添加M9盐的最小培养基由于溶解度方面的考虑，需要使用。
- 不溶性和分泌性蛋白质:最常见的纯化方案是为可溶性的囊性蛋白产品设计的，但这并不总是可以实现的。含有疏水区域或多个二硫键的蛋白质可能聚集而不溶。这些不溶的错误折叠的蛋白质团被称为包涵体，可以回收和纯化特殊协议．或者，降低诱导剂的浓度，或添加亲和性标签，如GST可能有助于解决溶解度问题。
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