在之前的质粒101系列文章中，我们了解了Cre-loxP重组系统可用于诱导位点特异性重组事件，并且侧翼loxP位点的方向指示Cre重组酶转化、转位或切除DNA片段。野生型和突变型loxP位点的可用性使科学家能够以新的、创造性的方式利用该系统。今天的帖子将关注一个人的uch战略Flex Switch.- 利用重组元素关闭一个基因的表达，同时同时打开另一个基因的表达！
什么是Flex开关？
Flex（或“佛罗里达州知识产权-前任切割开关被设计成一种遗传工具，供研究人员有条件地操纵基因表达体内使用位点特异性重组。FLEx开关利用位点特异性重组酶（SSR）Cre和FLP的方向特异性。SSR在目标位点结合DNA以诱导位点特异性重组事件：Cre重组酶结合loxP位点，而FLP结合FRT位点。当DNA序列两侧有目标位点时（FLOX）在相反的方向上，SSR将反转两个位点之间的DNA序列。如果DNA序列在同一方向上重叠，SSR将切除DNA片段。通过操纵重叠你感兴趣的基因的目标位点的数量、方向和类型，可以为你特定的实验需要创建一个强大的柔性开关。
柔性开关是如何工作的？
假设您想设计一个遗传柔性开关，关闭BFP表达，同时打开MCHERRY表达。对于该Flex切换成功工作，盒子需要在感测方向上包含BFP编码序列，然后是反义方向的MCHERRY编码序列（图1，顶部）。整个DNA暗盒将由两对靶位点（LOXP，黑色箭头）和一个突变对（例如 - LOX511，白色箭头）侧翼。有必要使用两对不同的目标站点进行这种策略，有效地工作。LOXP和LOX511都被CRE识别，但LOX511站点只能与其他LOX511站点重新组合，而不是LOXP网站。或者，您可以使用一对LOXP网站和一对FRT网站，并包括CRE和FLP重组酶。
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| 图1（由Schnutgen et al.Nat Biotech 2003修改）：基本FLEx switch将在没有Cre重组酶的情况下表达BFP，或在存在Cre重组酶的情况下表达mCherry。 |
一旦介绍了选择的SSR，重组就可以通过首先利用LOXP网站或LOX551位点进行。无论如何，第一个重组步骤将倒转使用loxP或lox511位点插入的DNA片段，在DNA片段的一端留下两个相同的位点（图1，中间）。然后发生第二次重组事件消费税相同的loxP或lox511位点之间的DNA（图1，底部）。由于只有一个loxP和lox511位点保留在DNA片段的两侧，因此即使存在Cre重组酶，也不可能发生任何额外的重组事件。该质粒现在特异性地驱动mCherry而不是BFP的表达。
除了切换荧光团之外，为什么Flex有用？
FLEx系统的功能在于有条件地关闭一个基因并激活另一个基因。在小鼠遗传学领域，FLEx目前被用于研究多种基因体内条件基因救援实验，以及改善致敏性adeno相关病毒（AAV）向量.下面列出了FLEx开关的一些附加用途：
- 对基因敲门的条件救援：为了测试您观察到的表型真的是由于在敲除鼠标中删除的单个基因，可以设计Flex Switch条件敲入盒式磁带。As shown in Figure 2, the cassette should contain a reporter DNA sequence (such as GFP) in the sense orientation, followed by coding sequence of the gene you would like to rescue with in the antisense orientation (let’s call the gene “GeneR”). The key to this experiment is the placement of the two pairs of target sites. By flanking the reporter with one loxP site and one lox511 site in the same orientation, and placing the additional loxP and lox511 sites after the inverted GeneR sequence in the opposing orientation, you have created a cassette that will express GeneR only in the presence of Cre. In this example, Cre would first倒转记者和生成片段。然后是第二个重组事件赢记者从纸盒，允许表达生物。这允许研究人员测试是否单独表达但是单独拯救正在研究的表型。
- 我引入条件点突变或功能突变体内:与基因野生型拷贝的条件拯救实验类似，您还可以设计FLEx开关，在缺少内源性基因的情况下，有条件地测试各种点突变和截断的功能。
- 视基因报告者的时空表达：由于大多数光生报告基因是通过AAV注射传递的，因此注射部位周围的大多数细胞将受到感染，并有可能表达转导的报告基因。生成一个柔性开关来控制光基因报告基因的表达，将确保报告基因在提供细胞或组织特异性Cre之前保持沉默。由于FLEx开关确保了Cre依赖性报告基因的表达，因此报告基因背景表达的可能性将大大降低，从而可以更清晰地描述目标神经元群体的位置、形态和电路图。
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| 图2（由Schnutgen et al.Nat Biotech 2003修改）：在存在Cre的情况下，GFP表达丢失，从而使GER的表达得以恢复。 |
有时也称为DiO(D盎司浮躁我逆转O令人诗型），Flex系统通常被认为是“CRE-on”，这意味着您的感兴趣基因从逆/反义“OFF”位置开始，并且在CRE存在下被翻转到方向（上）取向。可以使用类似的策略“Cro-Off”（即，您的感兴趣基因在感知方向上开始，CRE用于将其翻转到“OFF”）。这些Cref-Off开关可以称为DO（D盎司浮躁O并可用于研究某些细胞群的生理学或行为。
确认：
通过与Genovay的合作，我们能够分发包含FLEx技术的材料。阅读基因送释放想要查询更多的信息。
参考资料：
1.Schnütgen F、Doerflinger N、Calléja C、Wendling O、Chambon P和Ghyselinck NB.在小鼠细胞水平上监测Cre介导重组的定向策略。2003 PubMedPMID：12665802.
2. Branda，CS和Dymecki，SM。谈论革命：特定特异性重组酶对小鼠遗传分析的影响。2004. PUBMED.PMID:14723844.
3.阿塔德，阿彭特Y，苏HH和斯特森SM。2008FLEX开关将视紫红质-2引导至多种细胞类型，用于成像和远程电路映射。PubMedPMID:18614669. 公共医学中心PMCID：PMC2593125.
4. Saunders A，Johnson Ca，Sabatini BL。2012.新型重组腺癌相关病毒，用于神经元中的CRE活化和灭活的转基因表达。PubMed.PMID:2286602. 公共医学中心PMCID:PMC3406316.
从这些Addgene寄存者中找到FLEx质粒：
在Addgene Blog上额外重新排斥188博金宝官网
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