当面临克隆项目时，科学家不再局限于传统限制性内切酶克隆．相反,您可以选择一种分子克隆技术，在给定的资源、时间和实验需要下能很好地工作．Gateway克隆技术自上世纪90年代末发明以来，作为一种快速、高效地将DNA序列转移到多个载体系统的方法，已成为非常受欢迎的技术。有了适当的进入和目的载体，人们可以使用Gateway将感兴趣的基因克隆到各种表达系统中。请继续阅读，了解更多关于Gateway克隆方法及其优点。
网关技术简介
网关克隆方法，由表达载体，是一个在体外噬菌体感染细菌时发生的整合和切除重组反应的版本。我n体内t这些重组反应是由噬菌体附着位点的重组(丙氨酸P)及细菌(丙氨酸B)．作为attP和attB位点重组的结果，噬菌体在两个新的重组位点的两侧整合到细菌基因组中（丙氨酸l-左撇子丙氨酸R-right-，图1).在某些条件下丙氨酸l和丙氨酸R位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上的切除和再生丙氨酸P和丙氨酸B网站。
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图1:Lambda噬菌体整合和切除反应。attP和attB位点的重组产生attL和attR位点。 |
网关向量包含修改版本的丙氨酸这样科学家就可以很容易在他们想要的DNA序列中克隆。网关技术依赖于以下两种反应:
的英国石油(BP)的反应发生在丙氨酸B网站侧面的插入和丙氨酸P供体载体的位置。该反应由BP克隆酶混合酶催化，生成进入克隆包含着有价值的DNA丙氨酸l网站。作为反应的副产品ccdB从供体载体中切除基因。
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图2:Gateway系统采用噬菌体整合到BP和LR反应中。BP反应创造了一个attl侧翼的进入克隆。LR反应产生一个具有基因表达所需的所有成分的表达克隆。 |
的LR反应发生在丙氨酸l生成的条目克隆和丙氨酸R目标向量的站点。该反应由LR-氯酶混合物催化．因此，克隆表达与有兴趣的DNA丙氨酸B网站生成。和BP反应一样，含有ccdB从目的载体中切除基因．
一旦BP和/或LR反应完成，下一步就是转化合格大肠杆菌细胞，选择阳性克隆。输入克隆和目的载体携带不同的抗生素抗性标记(这里用质粒颜色表示)，允许您轻松地选择表达克隆。您还需要使用大肠杆菌应变敏感CcdB（如。Mach1 DH5α,全球)．的ccdB基因存在于供体载体中和目标向量在BP或LR反应中与感兴趣的基因交换。自CcdB蛋白抑制CcdB的生长大肠杆菌菌株，大多数菌落应包含所需的重组结构。请阅读我们最近发布的《质粒101》CcdB为更多的信息。
如何使用网关技术进行克隆
为了更好地理解这个过程，我们将通过一个示例实验，我们可能使用Gateway克隆来生成我们想要的结构:人类KRAS基因在哺乳动物细胞中的慢病毒表达。
步骤1:生成一个条目克隆
有几种不同的方法来生成我们想要的克隆人克拉斯的陪同下attL网站。
方法一:复合的丙氨酸B-PCR产物或含有丙氨酸P供体维克托r.在这种情况下，我们将使用PCR添加丙氨酸B站点的任意一端克拉斯编码序列。如果选择这种策略，重要的是要包含适当的蛋白质表达元素(核糖体识别序列、起始密码子、终止密码子、阅读框考虑等)．这个视频演示如何使用Snapgene程序设计网关质粒。
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图3:创建入口克隆的方法A:将attb侧链PCR产物与含attp的供体载体重组。 |
方法B:TOPO-cloning将所需的插入丙氨酸l-entry-TOPO向量。TOPO克隆增加了短端(s)，以方便克隆到丙氨酸l包含输入向量。
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图4：创建条目克隆的方法B:TOPO将插入克隆到包含条目向量的attL中。 |
方法C:限制克隆限制性内切酶片段的DNA丙氨酸l进口向量。该片段插入到一个。的多克隆位点(MCS)丙氨酸l包含输入向量。
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图5:创建条目克隆的方法C:限制将插入克隆到包含attl的条目向量中。 |
专家提示:Addgene也现成的条目克隆可用于许多流行基因，包括海关。KRAS4a．使用我们的网站来搜索你最喜欢的基因!
步骤2：生成表达式克隆
在进行表达克隆时，选择最适合您的实验的目标载体是很重要的。这种选择取决于许多因素，比如你的机体、期望的表达水平和实验目的。对于哺乳动物的慢病毒表达，我们可以使用像pLenti CMV Puro DEST (w118-1)或doxycycline-induciblepLIX_402．所选的丙氨酸R目标向量将与的在tl-entry clone创建克隆表达式。
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图6:生成表达式克隆。进入克隆和目的载体之间的反应产生两种产物:表达克隆和含有ccdB基因的副产物。由于ccdB产品对细胞有毒性，Gateway克隆效率可达>99%。 |
第三步:表达你的兴趣基因!
请确保验证您的表达式克隆的完整性通过测序或限制性消化！然后，您可以转换或转染您想用于实验的细胞，并验证您的构建是功能性的。
网关克隆方法的优点
兼容性和灵活性
一旦用感兴趣的DNA序列生成入口克隆，只需一个重组步骤，就可以在任何表达系统中移动这个DNA片段。Addgene现成的进入克隆可以与大量的质粒一起使用。
速度
与传统的限制克隆和连接克隆的2+天相比，Gateway系统仅能在1天内生成表达结构。在同一试管中建立BP和LR反应也有可能，加快克隆丙氨酸B-PCR产物直接进入目的载体。克隆过程很简单-不需要限制、连接或凝胶纯化步骤！
多个片段克隆
您可以使用网关克隆将多个DNA片段同时插入同一试管中的多个载体中。您可以在一个试管中以特定的顺序和方向将多达4个DNA片段克隆到一个网关载体中，以产生所需的表达克隆。由于网关向量的设计，这是可能的。他们已经修改了丙氨酸B，P，l和R非常具体和定向地重组的网站:丙氨酸B1网站仅对以下内容作出反应attP1网站;attB2只有attP2，attL1只有attR1；attL2只有attR2，等等。看看Addgene的一些Gateway多位点质粒，包括Frew实验室多慢病毒表达系统(MuLE)试剂盒,多站点网关克隆试剂盒，和多位点网关质粒．
不断的阅读框
当你将一个DNA片段从一个通道载体移到另一个通道载体时，插入的DNA片段会留在框架内。
高效率
Gateway克隆采用阳性(抗生素)和阴性(CcdB)选择标记，可将克隆效率提高到>99%。
普遍性
所有类型的DNA片段都可以克隆:PCR片段、cDNA或基因组DNA，从哺乳动物到所有种类的生物都可以克隆大肠杆菌．
网关克隆载体术语表
| 向量类型 | 向量的特性 | 目的 |
| 供体载体 | attP网站的重组;ccdB负选择基因 | 用于克隆丙氨酸B-侧基因产生的兴趣进入克隆 |
| 输入向量 | attL重组位点 | 用于生成进入克隆通过威尼斯平底渔船克隆或者限制克隆 |
| 目标向量 | 属性网站的重组;ccdB负选择基因;在适当的系统中表达感兴趣的基因的元素 | 与条目克隆重新组合以生成克隆表达 |
准备好尝试Gateway克隆了吗?
世界各地的许多科学家已经产生并保存了他们自己与Addgene的网关兼容质粒。这些基因可用于在各种模式生物中表达基因。使用以下链接查找您感兴趣的生物体的网关质粒：
工具书类
1.Chee JY, Chin CF(2015)网关克隆技术的优缺点。克隆Transgen 4:138。doi: 10.4172 / 2168 - 9849.1000138
2.哈特利杰。Gateway系统在多宿主蛋白表达中的应用。acta Curr Protoc Protein Sci. 2003 2月刊;第5章:第5.17单元。PubMedPMID：18429245．
3.Ptashne, m(1992)。基因开关:噬菌体(Lambda)和高等生物(剑桥，马萨诸塞州:细胞出版社)。
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
- 测试FastCloning
- 了解甲基化和限制性内切酶
- 使用菌落PCR快速验证您的克隆
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