在过去的十年中，科学家们已经开发和微调了许多不同的方法来克隆DNA片段，这些方法为人们提供了吸引人的选择限制性内切酶克隆．这些更新的技术变得越来越普遍，这是有原因的。与我们曾经完全依赖的传统限制性内切酶克隆相比，它们有许多优点。在这篇博文中，我将介绍一些优点和缺点，以及科学家们如何使用吉布森组装法将DNA片段组合在一起的例子。
作为一个有趣的开始，我强烈推荐你看这个有趣的视频由我们的朋友在剑桥2010 iGEM团队把吉布森组装的基本原理描述为对《蒂凡尼的早餐》(Breakfast at Tiffany 's)的拙劣模仿。
Gibson总成概述
吉布森组装技术是由丹尼尔·吉布森博士和他在j·克雷格·文特尔研究所的同事在2009年首次描述的。在Addgene，我们将这个选项添加到我们的下拉菜单中常见的克隆选项沉积过程因为它在2014年变得越来越受欢迎。众所周知，吉布森组装可以方便地组装多个线性DNA片段，但也可以用于将插入物克隆到选择的载体中，如下图所示。首先，你需要有末端有同源区域的DNA片段，这通常是由PCR产生的。然后，将这些碎片与含有三种不同酶的混合酶一起孵育:
- 外切酶，咀嚼片段的5 '端，产生长的悬垂，使具有同源性的单链区域退火
- 一种聚合酶，用来填补空白
- 一种DNA连接酶，用于封闭退火和填充缝隙的缺口
这种混合酶的最大优点是它们都能在相同的温度下工作，所以整个反应在50°C下需要一个小时或更少的时间完成。大约一小时后，样品立即准备转化为感受态细胞。酶的主混合可以从公司购买(如NEB或SGI-DNA)，也可以自己混合(如见米勒实验室协议）.吉布森组装过程可用于在一个步骤中组装多达6个片段，导致无疤痕组装，不需要存在特定的限制位点(或缺乏)，也不需要严重的时间承诺。这个过程的另一个优点是可以很容易同时生成野生型和突变型结构，而不是按顺序生成。
吉布森组装是如何工作的?
利用含有相应同源序列的引物进行PCR扩增，可以获得相邻片段之间所需的同源性。内建议重叠15-40 bp，底漆熔点温度大于48℃。Snapgene和NEB都有工具，可以帮助你设计PCR扩增片段的引物，以纳入这些同源区域。这个视频给出了一个有用的如何使用的示范Snapgene的计划为Gibson Assembly设计底漆。
举一个使用Gibson汇编的简单例子，假设您想要将您感兴趣的基因插入一个带有大标签在n端，但是你没有标记已经包含在你想要使用的向量中。如果你通过限制性内切酶克隆插入这两段DNA，你将不得不分两个步骤进行，而且两个片段之间可能会留下一道疤痕。但是，通过使用Gibson汇编，可以一次性将感兴趣的基因和标记序列插入到向量中，而不会产生如下所示的疤痕。首先，你需要设计引物来扩增这两个片段，同时也包括与载体或邻近片段的同源区域。然后你可以用PCR扩增片段和载体，验证你有正确大小的条带，并纯化DNA片段。最后，您只需将这三个片段与Gibson程序集主组件组合一起孵育1小时，然后转化为感受态细胞．这种反应的成功率通常是相当高的，所以通常不需要筛选大量的菌落。除去获得底漆的时间，你可以在5天内完成你的建筑。
吉布森组装技术的一个缺点是，这个过程对超过200个核苷酸的片段效果最好。这可能是因为核酸外切酶可以在退火和聚合步骤发生之前，将整个长度小于200个核苷酸的片段咀嚼完。其次,它不工作如果有稳定单链DNA片段的二级结构,如发夹或阻止循环(如预期可能发生在一个终结者序列),因为这将直接与所需的单链退火和邻近的启动大会碎片。
吉布森组装通常用于合成生物学，主要是因为在一个步骤中组装多个片段很容易，最终产品中不会留下疤痕序列。与具有限制性摘要的较小重叠序列相比，片段之间较长的重叠区域也能更好地确保片段的正确组装顺序。2013年的一项研究发现，吉布森装配是最常用的装配方法之一(2013年卡尔）.然而，吉布森组装并不理想的合成生物学标准，这依赖于重复使用部分实验。在Gibson组装中，每个片段的长引物必须被设计和排序，并且对每个片段以及你想要在它旁边的片段都是特定的，所以这不允许许多不同片段的混合和匹配。一种解决方法是使用带有重叠区域的标准序列组合，例如模态(使用连接器的模块化重叠定向装配)，将模块化引入到重叠定向方法(2014年极）.在这种情况下，连接序列被添加在同源区域之前，这允许混合和匹配的部分。
吉布森组装遇到CRISPR
Gibson可以适用于更复杂的克隆方案，比如你想要使用的载体非常大，GC含量高，包含很多重复——其中任何一个都可能使PCR步骤变得困难——或者没有方便的限制性位点用于线性化。这是一个完美的案例使用吉布森汇编与流行CRISPR技术并在Lockey实验室(Wang et al. 2015）.在本例中，我们没有使用限制性内切酶或PCR来制作线性化的载体，而是使用Cas9酶和特定的gRNA来切割22kb的载体。如果采用上面描述的标准Gibson组装技术，将导致直接无缝克隆到没有其他方法可用的载体中。最近还描述了使用吉布森汇编和CRISPR的第二个例子(Jiang et al. 2015)，其中非常大的细菌染色体片段(高达100 kb)通过CRISPR专门切割出来，然后使用吉布森组装成一个载体。在这种情况下，该载体经PCR扩增，含有与细菌染色体片段同源的区域。CRISPR切割是为了避免对染色体片段进行PCR扩增，这在技术上具有挑战性。
其他基于同源的技术
我们已经描述了序列与连接独立克隆(SLIC)在之前的质粒101文章中。尽管SLIC可能更具有成本效益，Gibson汇编在SLIC方法的两个方面进行了改进。首先，它使用专用的5 '外切酶而不是T4 DNA聚合酶的外切酶特征，而T4 DNA聚合酶必须由dntp的存在或不存在来控制。其次，在吉布森组装中添加连接酶来修复裂痕在体外,而在SLIC中，这些结构被修复在活的有机体内这最终会大大降低效率。
除了SLIC和Gibson，还有更多的基于同源性的组装方法已经被描述——CPEC(环形聚合酶延伸克隆)和SLiCE(无缝连接克隆提取)，这是另外两个例子。同样，市面上也有一些现成的克隆试剂盒，它们都是基于长重叠区域，不需要限制性内切酶，片段之间也没有疤痕序列。其中一些产品包括:
虽然这些套件的价格可能很高，但它们的制造商吹嘘其高效率和低时间承诺。这些套件也有具体的协议，产品插入比例的建议，以及底漆设计工具，所以最好总是检查来自您将使用的套件的特定制造商的说明。其中一些产品可能具有Gibson组装所没有的优势，如提高效率、缩短孵化时间或容纳较小片段的能力。
了解你的克隆方法
还有另外两种常见的克隆方法很容易与Gibson程序集混淆(它们都以G开头!)，但实际上使用的方法有很大的不同。金门克隆会导致片段的无缝连接，但使用位点特异性限制性内切酶(IIS型限制性内切酶)来切割识别序列之外的DNA。这要求载体和DNA片段在正确的位置包含这些位点，而不是在插入的中间。网关克隆利用λ整合酶催化定向克隆由整合酶识别的正交的attB和attP位点两侧的DNA部分。这种方法需要包含这些整合位点的专门载体，并在片段之间留下疤痕，但允许DNA片段从一个载体到另一个载体的轻松移动。
现在有很多不同的方法来克隆。Gibson和其他基于长同源性的克隆方法是标准限制/连接、Gateway或Golden Gate克隆方法的有用替代品。无论是常规克隆，组装多个片段，或合成生物学，你应该考虑给它一个尝试!
引用:
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其他资源:
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合成基因组公司授权新英格兰生物实验室使用Gibson Assembly®。
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