Addgene的质粒可用于多种限制性内切酶的克隆方法。每种方法都有自己的优点和缺点，但金门克隆在两者中都特别有用合成生物学和基因组工程字段。我们将向您介绍如何将这个精确且易于使用的系统应用到克隆工作中。
金门克隆技术依赖于1996年首次发现的IIS型限制性内切酶。IIS型限制性内切酶与“传统”限制性内切酶不同，它们在识别序列之外分裂，产生四个碱基侧翼悬垂。由于这些悬挑不是识别序列的一部分，它们可以被定制来直接组装DNA片段。如果设计正确，识别位点不会出现在最终的结构中，从而允许精确的、无疤痕的克隆。
克隆方案如下:将感兴趣的基因设计为位于裂解位点外侧的IIS型位点(如BsaI或BbsI)。因此，这些位点被消化/结扎所消除，并没有出现在最终的结构中。目的载体包含具有互补悬垂的位点，直接组装最终的连接产物。如下图所示，5 '悬垂TGGA和3 '悬垂TCCG的片段可以连接成含有这些悬垂的载体。入口DNA悬挑可能存在于原始质粒(选项1)或通过基于pcr的扩增添加(选项2)。
金门克隆的优势
从动手时间来看，金门克隆是最简单的克隆方法之一，因为一个30分钟的反应就可以完成消化和结扎。目的载体和进入载体被放置在含有IIS型酶和连接酶的单管中。尽管原始目标向量+插入可能会自发地生成，但这个临时构造保留了功能性的Type IIS站点，并将被重新整理。相反，所需的连接产物的形成是不可逆的，因为这种结构不保留酶的识别位点。因此，结扎过程的效率接近100%。金门克隆的另一个优势是它的可扩展性。独特的4个基悬垂可用于组装多个片段-多达10个片段通常组装在一个单一反应!这些突出部分指定了所需的片段顺序，而连接后酶识别位点的丢失有利于形成感兴趣的结构。虽然效率可能会随着片段数量的增加而降低，或者连接非常小/非常大的片段，但这些问题可以通过筛选更多的潜在克隆来克服。金门集会有几个优势其他克隆方法．Exonuclease-based方法如吉布森组装DNA片段末端需要20-40 bp的同源性才能确定组装顺序，所以5 '或3 '序列的片段不能用这种方法组装，可以用金门组装。受欢迎的网关克隆系统产生带有编码8个氨基酸的attB重组疤痕的结构，但金门组装可以被设计为无疤痕。金门组装也比许多商业克隆方法便宜。
金门和合成生物学
合成生物学家利用了金门克隆技术的力量，制定了模块化克隆策略。这种策略有时被称为MoClo，它使用IIS型限制性内切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地组装多达6个DNA片段。与所有基于金门的方法一样，该系统利用IIS酶在识别位点外切割的能力，并允许具有兼容悬垂的DNA片段被有效组装。科学家们可以设计独特的酶识别位点，使其以相反的方向侧切DNA片段。这允许多个DNA成分(启动子、基因、终止子等)在单个反应中以正确的顺序组装。有关详细的金门协议，包括有用的提示和技巧，请参阅塞恩斯伯里实验室网站或断& Marillonet．
金门事件和基因工程
2011年初，Bogdanove和Voytas小组描述了一种新的黄金Gate-based技术用于基因组编辑，允许多个DNA片段的有序组装，以创建TAL效应核酸酶。这些质粒利用了BsaI和BsmBIIIS类型这样的网站,定制TAL数组只需几个步骤就可以快速有效地构建。最近，CRISPR技术已经适应了Golden门的克隆将指定gRNA目标序列的适当寡核苷酸插入含有cas9的质粒中，例如pX330．这种克隆策略不仅可以容易地获得单个表达grna的质粒，而且可以适用于表达多个grna。Addgene已经两种基于金门的gRNA组装方法它允许您高效地将多达7个grna克隆到一个目标向量中，使多路复用变得容易。
金门克隆的缺点
金门克隆不是100%序列独立的:为了避免不必要的消化，所使用的Type IIS站点必须不在您想要组装的片段中。解决这个问题的一种方法是“驯化”你的片段:基于pcr的扩增可以用来在内部识别位点创造沉默点突变，从而从你感兴趣的基因中消除这些突变。PCR产物随后与IIS型酶消化，混合物在热失活步骤后连接。如果您感兴趣的基因或目的载体包含多个内部限制位点，可能不适合“驯化”，您可能需要考虑使用Gateway克隆或Gibson组装等替代方法。另一个重要的考虑是侧翼悬垂的设计。虽然理论上有256个不同的侧翼序列，但只有一个碱基不同的序列可能导致意外的连接产物。
无论你是否使用金门方法来创建CRISPR/Cas9结构，组装标准质粒部件在不同的组合,或者其他令人兴奋的新应用，这个系统是一个非常强大的工具，可以在一个简单、高效的步骤中克隆复杂的结构。
引用:
用iis类限制性内切酶串联多定时器序列扩增克隆DNA。李JH, Skowron总理，Rutkowska SM, Hong SS, Kim SC。麝猫肛门。1996年12月,13(6):139 - 45。PubMed。
采用一锅一步精确克隆的方法，具有高通量能力。Engler C, Kandzia R, Marillonnet S。《公共科学图书馆•综合》杂志2008;3 (11):e3647。doi: 10.1371 / journal.pone.0003647。Epub 2008 11月5日PubMed。
高效设计和组装定制TALEN和其他基于TAL效应的DNA靶向结构。Cermak T, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C, Baller JA, Somia NV, Bogdanove AJ, Voytas DF。核酸Res。2011年7月,39 (12):e82。2011年4月14日。PubMed。
金门克隆。Engler C, Marillonnet S。杂志的方法。2014; 1116:119-31。doi: 10.1007 / 978 - 1 - 62703 - 764 - 8 - _9。PubMed。
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