绿色荧光蛋白(GFP)等蛋白质的生物发光和荧光可能已经在水母等生物中存在了数百万年;然而，直到20世纪60年代，科学家才开始研究GFP并推断其生化特性。现在，绿色荧光蛋白及其荧光衍生物是实验室的主要研究对象。绿色荧光蛋白被广泛应用于生物学科的研究中，科学家使用绿色荧光蛋白具有广泛的功能，包括:标记基因以阐明其表达或定位概况，作为生物传感器或细胞标记，研究蛋白质-蛋白质相互作用，可视化启动子活性，等等。
继续阅读，了解更多关于绿色荧光蛋白的知识，科学家是如何进化出这种多功能蛋白质来满足他们的实验需要的，以及在实验室中的一些常见应用。
为什么是绿色荧光蛋白?
GFP是一种约27kda的蛋白质，由238个氨基酸组成，来源于水晶水母Aequorea victoria．它在可见光谱的绿色部分有荧光发射波长(因此得名)，这是由于蛋白质中心三个特定氨基酸(Ser65, Tyr66和Gly67)的成熟反应形成的发色团。当第一次发现GFP时，最令人惊讶的方面之一是，发色团自发形成，不需要额外的辅助因子、底物或酶活性- - - - - -它只需要在成熟过程中有氧气的存在。这意味着蛋白质可以直接从答:维多利亚并在任何生物体中表达，同时仍保持荧光。
该蛋白质结构于1996年首次被报道，是一个包含11个β层的“桶状”结构，发色团隐藏在结构的中心，避免被水溶剂淬灭。这种紧密排列的结构解释了整个GFP蛋白的重要性，它几乎完全需要维持荧光活性;极少的截断是可以容忍的，但是点突变是可以接受的。与当时的传统荧光染料相比，GFP的主要优势在于它无毒，可以在活细胞中表达，从而可以研究动态的生理过程。
重新设计GFP，以增加其颜色和应用范围
几乎在它的序列被阐明之后，科学家们就开始通过诱变来改造新的GFP，以改善其物理和生化特性。在1995年，Roger Y. Tsien描述了一个S65T点突变，它增加了荧光强度和耐光性GFP。这也将其主要激发峰从395 nm转移到488 nm，有效地改善了野生型蛋白的缺陷，促进了其在研究中的广泛应用。许多其他的突变被引入到GFP中，新的荧光团不断被设计。下面的表1列出了几种常见的荧光蛋白及其相对于野生金宝搏app下载型GFP的突变。虽然没有在这里列出，许多渗透在每个颜色也存在，只有轻微的变化分开他们。
请注意在光谱中发现的许多荧金宝搏app下载光蛋白并不是GFP的衍生物，而是与从其中分离出来的dsRed蛋白有关Discosoma sp。在扩大红色荧光蛋白库方面也做了类似的工作;然而，这些蛋白质与GFP和突变定义不同见表2可能不适用。
表1:常见荧光团的具体突变
| 荧光蛋白 | 与野生型GFP相关的突变 |
| EGFP | F64L;S65T |
| EYFP | S65G;V68L;S72A;T203Y |
| mYFP | S65G;V68L;Q69K;S72A;T203Y;A206K |
| 黄水晶 | S65G;V68L;Q69K;S72A;T203Y |
| 森林 | F64L;S65T Y66W;N146I;M153T;V163A |
| mCFP | F64L;S65T Y66W;N146I;M153T;V163A;A206K |
| 天蓝色的 | F64l, s65t, y66w, s72a, y145a, h148d, n149i, m153t, v163a |
| EBFP | F64l, s65t, y66h, y145f |
表2:GFP衍生物中特异性突变的功能作用
| 突变 | 已知函数 |
| S65T | 荧光增强，光稳定性增强，主激发峰移至488 nm |
| F64L | 提高折叠效率37摄氏度 |
| Y66W | 使发色团与吲哚而不是酚组成(青色衍生物)。 |
| Y66H | 波长蓝移(蓝色导数) |
| Y145F | 增加BFP的量子产率 |
| Y145A和H148D | 稳定的结构天蓝色的衍生品 |
| F99S、M153T V163A | 改善37℃时的折叠，降低高浓度时的聚集 |
| T203Y | 红移波长(黄色导数) |
| A206K | 干扰二聚体界面(单体衍生物) |
| K26R, Q80R, N146H, H231L，(可能还有其他) | 中性突变 |
多种应用
由于它的大小和易于使用，GFP和其他荧光蛋白已经成为分子生物学的支柱。金宝搏app下载科学家可以很容易地利用含有gfp的质粒作为实现许多功能目的的手段。我们已经在下面列出了我们最喜欢的，但目前还有许多其他用途，新的GFP技术正在不断开发!
- 融合标签:最常见的用途之一是，绿色荧光蛋白可以融合到蛋白质的N或c端，这让科学家可以看到基因何时何地表达。点击这里查看Addgene收集的用于构建荧光融合的空骨干。
- 记者:转录将GFP置于感兴趣的启动子的控制下，可用于有效地监测该启动子在给定细胞类型中的基因表达。这种类型的转录报告是绿色荧光蛋白最早的应用之一。
- Förster共振能量转移(FRET):这是用来研究两个蛋白质之间的相互作用或蛋白质的两个结构域之间的构象变化。通常使用两个具有重叠激发/发金宝搏app下载射光谱的荧光蛋白;一个融合到每一个被测试的蛋白质或结构域。在这里找到FRET质粒。
- 将EGFP:作为FRET的一种替代方法，split EGFP也被用于蛋白质相互作用的研究。在这种情况下，EGFP的两部分与感兴趣的蛋白质融合，当它们靠近时，EGFP的两半进行折叠、成熟和荧光。
- 生物传感器:大量基于gfp的荧光生物传感器已被设计用于检测各种细胞内条件，包括离子(如钙离子)2＋)浓度和pH值，使用一系列策略，如FRET，钙调素和其他。在此回顾Addgene收集的荧光生物传感器。
- 光遗传学:科学家可以利用光来探测、测量和控制分子信号、细胞和细胞群，以便了解它们的活动，并可视化改变这种活动的影响。在OpenOptogenetics了解更多关于光遗传学的信息和在Addgene找到光电致动器和传感器。
- 细胞标记/选择:像质粒这样的表达结构通常包括GFP作为标记，以帮助识别哪些细胞已经成功地获得了质粒。这可以作为抗生素选择的替代品。这类质粒的GFP可能受感兴趣基因的附加启动子的控制，或由与感兴趣基因相同的转录本表达，但在一个内部核糖体进入位点(IRES)之后。这通常与FACS一起使用(见下文)。
- 荧光激活细胞分类(FACS):这是一种基于荧光信号将细胞混合物分离成不同群体的流式细胞术。因此，流式细胞术可用于分离表达GFP的细胞和不表达GFP的细胞。
- 发展/转基因用途:由于其稳定性，GFP可用于细胞命运研究的谱系追踪能力。当受感兴趣的启动子控制时，它也可以用来观察这些启动子活跃的发育阶段。此外，GFP可以标记转基因修饰的ES细胞，然后用于植入和产生转基因小鼠。
- 净化:GFP可作为蛋白纯化的通用抗原表位标签，目前已有许多商品化的GFP抗体。
- 其他:我们只是触及了GFP潜在应用的表面。它还被用于在药物筛选中识别特定的细胞群，在癌症研究中可视化裸鼠的微转移，作为DNA双链断裂修复的报告器，以及标记致病性细胞内微生物以可视化宿主/病原体的相互作用。
你有最喜欢的使用GFP的方法吗?请评论并告诉我们怎么做!
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注:A. Max Juchheim对本文的写作有贡献。
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