恭喜你，你有了一个表达你感兴趣的基因（YGOI）的质粒，准备投入你的功能实验！无论你是自己克隆的质粒还是从大厅里的同事那里获得的质粒，都最好花点时间确认你使用的是正确的结构，并验证你收到的质粒与预期的序列匹配。在Addgene，我们使用NGS-based质量控制以确定我们所分配的所有质粒的序列。这种方法是耗时的，所以我们推荐一个多种方法来筛选和验证你的质粒．在这里，我们将介绍限制摘要分析。
诊断限制消化
诊断摘要可用于根据预测的大小和组织确定质粒的大致结构不同的特性在质粒内。即使没有完整的质粒序列，也可以成功地使用限制性分析。一旦你纯化了质粒DNA，这种方法就可以在你的实验室在不到一天的时间内完成。诊断限制性内切酶由两个单独的步骤组成：1）用限制性内切酶在特定位置切割DNA分子，2）在琼脂糖凝胶上进行反应，以确定产生的DNA片段的相对大小。
限制性酶切通常用于确认特定载体中插入物的存在，方法是将插入物从主干上切除。要做到这一点，你需要在插入的侧翼使用带有限制位点的酶。你需要知道它的近似大小向量主干以及插件的预测大小。你可以搜索NCBI如有必要，YGOI可找到特定的参考序列。
右边的示例质粒的总大小为7.3kb，包括1.2 kb的插入。质粒被两种独特的酶消化(HindIII和BamHI)用琼脂糖凝胶跑步。得到的凝胶图像包括一个1kb的阶梯(1巷)，其条带范围约为500bp至10kb，其中3.0kb片段的强度增加，作为参考条带。未被切割的DNA(第2道)显示了3种可能的质粒构象，并以星号(*)标记。当质粒被其中任何一种消化时只有印地安人和巴米人（通道4-5），有一条7.3kb的单带代表质粒的完整大小。HindIII和BamHI（通道3）的双摘要分别产生6kb和1.2kb（红盒）的谱带，分别与主干和插入相匹配。凝胶上的结果与预测尺寸一致。
观看这个视频，快速了解如何分析限制摘要:
限制消化提示和技巧:
以下提示将使您更容易获得有用和信息丰富的诊断限制摘要。
对你的消化:
- 试着选择一些独特的酶。只切割一次的酶可以让你更容易和准确地想象你的结构的完整尺寸。
- 考虑缓冲和温度兼容性当用一种以上的酶消化时。有关最佳工作条件，请参阅制造商手册每个酶．
- 注意甲基化问题。XbaI和cli等酶对甲基化很敏感，它们的活性可能被阻断。如果你必须使用这些酶来消化，你需要从dcm或dam methyl- deficient菌株(如JM110或INV110)中净化你的DNA。
- 避免明星活动。一些核酸内切酶（例如BamHI）能够切割与其定义的识别序列相似但不完全相同的序列。大多数酶制造商生产高保真版本的核酸内切酶和/或提供定制缓冲液作为避免这一问题的手段。
为你的凝胶:
- 倒入凝胶前，向凝胶中加入溴化乙锭(EtBr)。EtBr与DNA结合，允许你在紫外线下观察DNA。
- 不要忘记在加载消化反应之前添加加载缓冲。缓冲液中的甘油将确保您的样品在凝胶中沉淀良好，染料提供了一个视觉参考点，因此您可以轻松评估凝胶已经运行了多远。奖金：染料也按预计尺寸运行这样你就可以根据染料来估计你的带在凝胶上走了多远!
- 总是跑梯子。梯子可以让你理解你在样品车道上得到的条纹。根据预期的带子大小选择你的梯子。
- 一定要控制未切割的DNA，以确保你的酶是有效的。当分离未切割的质粒DNA并在琼脂糖凝胶上运行时，您可能会看到3条带。这是因为环状DNA具有几种最丰富的构象：超螺旋、松弛和缺口。如果你的消化道看起来像你的未切割车道，那就有问题了！
- 量化你的DNA．装载过多的DNA将使获取清晰的条带和分析结果变得困难。奖金：知道你在每口井里装了多少DNA将使你能够近似DNA质量数量相近，强度相当的样本。
- 在80-150V下运行凝胶，直到你的条带之间有很好的分离。当溴酚蓝染料线沿凝胶向下约75-80%时停止凝胶，可以确保较小的条带不会脱落;然而，您可能需要运行凝胶更长的时间，以实现较大的DNA片段的良好分离。
我希望这些提示说明质粒验证不仅是必要的，而且是一个简单的过程。请参观用于质粒验证的Addgene资源查找关于以下主题的附加提示和详细协议如何设置你的摘要和注入/运行DNA凝胶．
更多质粒教育资源:
主题:质粒101，分子生物学协议和提示，质粒
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