在过去的20年里，荧光成像技术已经成为分子和细胞生物学家不可或缺的工具，但它们的使用可能受到一些注意事项的限制。自金宝搏app下载荧光蛋白(FP)需要外部光激活，不能使用荧光来监测直接受光影响的过程。长期暴露在光照下也会导致细胞的光毒性，而实验的成功也会受到自体荧光和光漂白的影响。研究人员一直对利用发光来解决这些问题很感兴趣，但由于发光蛋白的强度低，这种解决方案并不实用。为了使发光成像成为现实，Addgene depositorTakeharu Nagai和大阪大学的同事开发了纳米灯技术。纳米灯包含一种Renilla荧光素酶变体与FP融合;当提供荧光素酶底物时，荧光素酶将能量转移到FP，产生荧光信号。自2012年首次发表论文以来，永井实验室已经组装了一套多色纳米灯，用于各种应用，包括光遗传学、生物传感器和融合蛋白。
解决了低发光问题
Renilla荧光素酶本身的量子产率很低，当在细胞中短暂表达时，产生的信号比同类荧光蛋白要少得多。金宝搏app下载这种微弱的发射并没有阻止一些科学家使用化学发光蛋白进行成像，但它阻止了这项技术的广泛采用。
在2012年,斋藤等。描述了第一盏纳米灯，一种突变的Renilla荧光素酶(RLuc8)与金星的融合。这种发光技术基于生物发光共振能量转移(BRET)原理。光子由Renilla荧光素酶变异是用来激发荧光蛋白融合．这种技术与广泛使用的FRET非常相似，但它消除了对激发光源的需求。相反，在培养基中提供一种荧光素酶底物，如coelenterazine，以允许RLuc8产生光子。
原始的纳米灯发出黄绿色的光，亮度比以前的BRET探测器提高了3-5倍，有足够的信号在活的有机体内和在体外成像。Saito等人使用这种纳米灯对静脉注射coelenterazine的自由活动小鼠标记的肿瘤进行成像，与之前的出版物相比，其灵敏度更高，成像速度更快。他们还开发了基于纳米灯的钙、cAMP和ATP传感器，显示了该技术的通用性和对许多不同环境的适应性。
改善Nano-lanterns
在2015年,Takai et al。扩展了纳米灯的调色板，包括青色和橙色的纳米灯，并表明这三种发光蛋白质可以在细胞中一起使用。由于纳米灯不受光漂白/光毒性影响，他们使用纳米灯融合蛋白在几分钟内成功地对多个亚细胞室进行了成像。为了进一步提高长期成像能力，他们合成了双乙酰coelenterazine-h。与coelenterazine-h不同，双乙酰coelenterazine-h不会自氧化并产生背景荧光，因此可以向培养基中添加更高浓度的化合物。然后，细胞酯酶将双乙酰coelenterazine-h转化为coelenterazine-h，产生稳定的底物供应。Takai等人利用这种化合物激发纳米灯，连续成像细胞约4小时!
铃木等人所描述的最新增强纳米灯(eNL)将以前的纳米灯的亮度提高了2-4倍，并允许五色荧光成像!这些eNL结构物使用最亮的荧光素酶NanoLuc及其底物呋喃嗪。除了前面描述的应用，eNL的增强信号使其首次用于单分子成像。
纳米灯和你的实验
永井实验室已经完成了一项出色的工作，为许多不同的应用描述了纳米灯和eNL。对于长期成像，特别是光漂白和光毒性问题，这些结构非常方便。这种方法特别适合于补足optogenetic工具在这种情况下，用于激发的光线会导致光发生系统的意外激活。基于纳米灯技术的生物传感器也非常强大，基于enl的钙传感器在钙结合时显示500%的信号变化。Suzuki等人也认为eNLs可以作为内源性蛋白融合的良好报告基因CRISPR / Cas9．eNLs为低拷贝数蛋白的成像提供了高的发光信号，但由于自身荧光和高信噪比，使用荧光成像很难进行检测。
尽管纳米灯技术有许多好处，但与发光成像相关的一些缺点:
- 成像需要一个发光的衬底，验证这个衬底不会改变你系统中的细胞生理学是很重要的。
- 由于没有外部光源，光学切片无法进行发光成像。因此，特别厚的样品可能不适合使用纳米灯技术。
- 多色成像使用纳米灯需要一个线性分解算法来分离各种颜色。在荧光成像中，使用激发波长指定要捕获的FP发射。由于纳米灯系统不使用外部光来激发，你不得不依赖于发射波长的不同。通过过滤发射波长，可以部分分离各种纳米灯的信号，但并不能分离每个纳米灯，因此Takai等人使用线性分解算法来解码单个颜色。Takai等人进一步解释了该算法的发展。
纳米灯和现成的纳米灯生物传感器可从Addgene!
参考文献
斋藤，Kenta等，“高速单细胞和全身成像的发光蛋白质”。Nat Commun。3(2012): 1262。PMID: 23232392PMCID: PMC3535334
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实时多色发光成像的纳米灯的扩展调色板。美国国立科学院科学研究所112(14)(2015): 4352 - 6。PMID: 25831507．PMCID: PMC4394297
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实时多色生物成像的五种不同颜色的发光蛋白。Nat Commun。7(2016): 13718。PMID: 27966527PMCID: PMC5171807
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