质粒101:甲基化和限制性内切酶

您是否尝试过使用XbaI或cli限制性内切酶进行消化，并得到了不寻常或意想不到的结果?或者考虑为什么DpnI会降低你的模板DNAPCR反应但不是定点突变实验新合成的产物吗?这两个问题的答案是一样的——甲基化!继续读下去，了解DNA甲基化是如何影响你的restriction消化．

为什么混入甲醇?

限制性内切酶在实验室中是如此普遍，以至于很容易忘记这些酶在细菌中自然存在的目的不是为了克隆或证实了质粒．事实证明，限制性内切酶是原核生物用来保护自己免受外来DNA伤害的自然限制性内切修饰系统的一半。这些系统的另一个组成部分，甲基转移酶，在特定的序列上甲基化DNA，以防止它们被限制性内切酶降解。一个给定的原核生物通常具有编码一个或几个限制性修饰系统的基因，该系统包含甲基转移酶，将甲基添加到特定的DNA序列中，以及识别并切割相同的DNA序列(如果它来自噬菌体)的内切酶。

除了限制性修饰系统，DNA甲基化还在调控基因组复制、修复DNA合成过程中出现的错配碱基对或小插入、促进或抑制蛋白质表达等方面发挥着不可或缺的作用。参与这些过程的甲基化酶(如Dam和Dcm甲基化酶)独立于限制性修饰系统，但仍然会影响某些限制性内切酶是否能有效地切割DNA。

常见的实验室大肠杆菌K12菌株，如dh5 α，包含3种甲基化酶，识别和甲基化不同的DNA片段:

• 甲基化酶在G一个DNA的TC延伸
• 甲基化酶在C的第二个胞嘧啶上加一个甲基CWGG
• EcoKI甲基化酶在a一个CNNNNNNGTGC或GC一个CNNNNNNGTT

对克隆和消化的影响

虽然不是所有的原核DNA都被甲基化到相同的水平，但在消化DNA时应该考虑甲基化的潜力。为什么?虽然Dam甲基化位点与任何限制性修饰系统都没有特别的联系，但它们的序列可能与限制性位点重叠，抑制酶如cli或XbaI，或相反，激活酶如DpnI。

例如，如果酶的识别位点(TCTAGA)之前有GA或之后有TC, XbaI的切割可能会由于甲基化而被阻断。如下图所示，一个Dam甲基化酶识别位点(红色下划线)与XbaI切割位点(橙色线)重叠，因为限制位点后面跟着TC。在这个位点上添加甲基会阻止酶切割那里的DNA，尽管其他的限制位点(包括没有经过GA或TC的其他XbaI位点)会被正常切割。如果不加以考虑，这个被封锁的站点可能会给你带来难以解释的结果，或者导致你得出结论，你的质粒是不正确的!

相反，像DpnI这样的酶需要在它们的识别位点上进行甲基化才能有效地切割DNA。DpnI常用于位点定向突变。在这个过程中，通过PCR将一个想要的突变合并到你感兴趣的质粒中，生成没有甲基化的突变质粒(在PCR反应中没有甲基转移酶)。另一方面，模板质粒应该是从大坝+大肠杆菌因此，腺嘌呤在任何质粒中发现的GATC序列。当PCR产物被DpnI酶切时，只有未突变和甲基化的模板被破坏，留下一个突变质粒库，以后可以被破坏经Sanger测序验证．

我怎么知道我的酶是否会切断?

无论是出于克隆目的还是诊断目的执行摘要，我们建议进行双重检查，以确保结果不会受到甲基化的影响。方便的是，实验室中常用的大多数限制性内切酶都没有可以与甲基化位点重叠的识别位点。快速参考表列出了可能受甲基化影响的10种常见酶。此表并非详尽无遗，因此您可能需要查阅变基数据库查阅更详细的资料。