质粒101:多顺反子载体

多基因的共表达在许多实验环境中是有价值的。为了实现这一目标，科学家们使用了多种技术，包括两个或多个质粒的共转染，使用多个或双向启动子，或创建双反子或多顺反子载体。不同于启动子将为每一个被表达的基因创建独特的mRNA转录本，多顺反子载体同时从同一个mRNA表达两个或更多独立的蛋白质。我们已经讨论了启动子在此之前，我们将介绍多顺反矢量的基础知识:为什么它们有用，它们是如何工作的，以及如何开始使用它们。

为什么使用多顺反矢量?

检测表达基因的细胞，尤其是在研究新基因时，并不总是一个简单的过程。科学家们不再尝试直接检测你感兴趣的基因，而是开发了新的方法，将你的基因与报告基因共同表达，比如荧光基因或抗性基因。这些报告器可以让你很容易地筛选或选择那些表达你感兴趣基因的细胞。不同于从一个独特的启动子中表达可筛选或可选择标记的载体，多顺反子质粒确保任何标记阳性的细胞也应该表达你的基因，因为它们都来自相同的转录本。

当然，多顺反矢量不一定要专门用作检测手段;当你想在同一个细胞中表达多个基因时，它们几乎是有用的。虽然可以通过使用带有多个单独表达盒的质粒来驱动共表达，但从同一盒表达基因有时是有利的，特别是当只有一部分质粒被包装时病毒交付，或两个或多个基因之间的相对表达水平是重要的。

多顺反矢量是如何工作的?

科学家们已经“借用”了在正单链RNA病毒中发现的一些技巧，以便从一个单一的转录本中有效地翻译多个基因。以下描述了两种最广泛用于研究目的的质粒策略。

IRES元素

在真核生物中，翻译通常从5 '帽开始，因此每个mRNA只有一个翻译事件发生。然而，一些双反子载体利用一种称为内部核糖体进入位点(IRES)的元素，允许从mRNA的内部区域开始翻译。

在上图中，你可以看到IRES元素作为另一个核糖体募集位点，从而导致一个mRNA中两个蛋白的共表达。

IRES最初是在脊髓灰质炎病毒RNA中发现的，它促进真核细胞中病毒基因组的翻译。^1，2从那时起，各种各样的IRES序列被发现——许多来自病毒，但也有一些来自细胞mrna。它们的共同之处在于能够触发独立于5 '帽的翻译启动。

IRES元素非常有用，在双反子载体中普遍存在;然而，它们也有一些缺点。这些元素相当大(500-600 bp)，在包装能力有限的病毒转移载体中可能占据宝贵的空间。此外，使用IRES元件一次表达两个以上的基因可能是不可行的。此外，科学家们报道，由于实验细胞类型和克隆到载体中的特定基因等因素，下游顺反子的表达较低。^3.

2肽

为了克服IRES元素的一些缺点，科学家们已经将“自裂解”2A多肽转化为它们的多分子载体。这些肽最初是在小核糖核酸病毒,是短的(大约20个氨基酸)，并从相同的mRNA产生等摩尔水平的多个基因。术语“自我分裂”并不完全准确，因为这些缩氨酸被认为是通过制造核糖体跳过2A元素c端肽键的合成，导致2A序列末端和下游下一个肽之间的分离。⁴在c端发现的甘氨酸和脯氨酸残基之间发生“裂解”，这意味着上游顺反子将有一些额外的残基添加到末端，而下游顺反子将从脯氨酸开始。

下表列出了科学家常用的四种2A肽。2A裂解在真核细胞中是普遍存在的，尽管一些科学家报告说，其中一些肽的裂解率接近100%，但对于哪一种肽的工作效果最好，还没有达成共识。很可能，特定2A肽的选择最终将取决于一些因素，如细胞类型或实验条件。

* (GSG)残基可以添加到肽的5'端，提高裂解效率。

我该如何开始?

如果你想将你感兴趣的基因与荧光蛋白或可选择的标记物共同表达，最简单的方法是从已经克隆了多顺反子元件和报告基因的质粒开始。在这些质粒中，你可以简单地将你感兴趣的基因克隆到IRES或2A元件的多克隆位点上或下(取决于报告基因的位置)。

Addgene的收集提供了多种表达两个或多个基因的质粒，其中一些在下面列出。我们应该注意到这些载体主要为双反子表达而设计;然而，许多基因可以很容易地被操纵来表达两个以上的基因。

对于多个独特基因的共同表达，你可以从一个在多顺反子元件侧面有多个克隆位点的质粒开始，或者你可以用你的基因或感兴趣的基因替换上面的一个报告基因。其中一些质粒列于上表(及其相关质粒)被设计用来替换一个或多个基因。

此外，2A多肽可以在你感兴趣的基因之间进行pcr克隆，然后你可以将整个多顺反盒式结构作为一个单一单元插入主干。虽然我当需要化学计量学上等效的表达水平时，建议使用2A多肽而不是IRESe还应该注意，IRES和2A肽并不是相互排斥的元素。实验室已经成功地在同一个多顺反子载体中利用了2A和IRES元素，有效地构建了一个在IRES荧光报告上游以等效水平表达多个独特基因的结构，便于检测。⁵

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引用:

1.由脊髓灰质炎病毒RNA序列引导的真核mRNA翻译的内部起始。Pelletier等(《自然》。1988年7月28日;334(6180):320-5。)PubMed．

2.在体外翻译过程中，脑心肌炎病毒RNA的5'非翻译区片段指导核糖体的内部进入。(J Virol. et al.)1988年8月,62(8):2636 - 43)。PubMed．

3.高效多顺反子慢病毒载体与肽2A序列。188完整比分直播易卜拉欣等(嗡嗡声其他基因。2009年8月,20(8):845 - 60。doi: 10.1089 / hum.2008.188。）PubMed．

4.从猪teschovirus-1中提取的2A肽在人细胞系、斑马鱼和小鼠中的高切割效率金等人(PLoS One。2011; 6 (4): e18556。doi: 10.1371 / journal.pone.0018556。2011年4月29日。）PubMed．

5.由T细胞抗原受体cd3 ITAMs介导的可扩展信号保证了有效的阴性选择并防止自身免疫。Holst等人(Nat Immunol. 2008 6月;9(6):658-66。doi: 10.1038 / ni.1611。Epub 2008 5月11日)PubMed．

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