质粒101：限制性克隆

当通过限制性内切酶和结扎进行克隆时，使用限制性内切酶切开质粒(主干)，插入被兼容限制性内切酶切过的线性DNA片段(插入)。一种酶，DNA连接酶，然后以共价将质粒与新的片段结合，从而产生一个完整的，圆形的质粒，可以很容易地维持在各种生物系统中。请继续阅读如何执行限制摘要的深入分析。

限制克隆过程概述。质粒(蓝色，主链)和感兴趣的DNA序列(绿色，插入)都被限制性内切酶切断，以产生相容的悬垂物，使它们能够结合。连接酶用于在插入物和主链共价键之间形成键。

在开始限制消化和结扎过程之前，你应该小心选择你的支柱插入-这两个都必须有兼容的切酶位点允许插入物以正确的方向插入主链。例如，如果你要将一个基因克隆到表达载体中，你会希望基因的起始点位于主链启动子的下游。理想情况下，主链将包含启动子下游的各种限制性内切酶切位点(限制性内切位点)，作为启动子的一部分多克隆位点(MCS)．有多个位点可以让你很容易地定位你的基因插入与启动子．

例如，假设你的质粒骨架看起来像下图左边的那个。它有一个启动子(蓝色箭头)，后面是限制位点EcoRI, XhoI和HindIII。为了将你的基因置于启动子下游的合适位置，你可以在基因起始位置的5 '处添加一个EcoRI位点，在基因结束位置的3 '处添加一个HindIII位点。这样你就可以把质粒骨架以及插入和EcoRI HindIII,削减产品混合在一起时,两个EcoRI消化结束将退火和两个HindIII消化结束将退火留下的5 '末端基因启动子的下游,将在适当的方向。然后在混合物中加入连接酶以共价连接主链，然后插入，很快，你就有了一个完整的质粒，可以在实验中使用。

或者，如果插入物的两侧都是酶的限制位点，那么整个过程可以用一种酶来完成，但是插入物可以向前或反向退火到主干上，所以你需要一些方法来验证插入物是否在你想要的方向上-通常是通过年代愤怒排序或进一步的限制性消化。

当然，要使流程正常运行，还需要更多的细节和验证，所以让我们来看看”let’让我们一步一步地过一遍细节。

1.消化

设置限制消化用于插入（或供体质粒）和质粒骨架。因为在凝胶纯化步骤中会丢失一些DNA，所以消化大量的起始物质很重要。我们建议插入1.5-2μg，质粒骨架1μg。用两种酶切割尽可能多的骨干质粒也是至关重要的，因此消化过程必须持续到完成。完全消化所需的时间因酶而异。许多公司现在出售的快速消化酶可以在10分钟内消化大量DNA，但请咨询酶的制造商，确保切割的持续时间和使用的条件正确。

箴提示!

如果你只打算使用一种限制性内切酶，或者酶在消化后有相容的外切酶或没有外切酶，你需要使用磷酸酶来防止主链质粒的再循环(见下文)。您应该在连接步骤或凝胶纯化步骤之前，根据您选择的磷酸酶，用磷酸酶处理已消化的主链质粒。CIP(犊牛碱性磷酸酶)或SAP(虾碱性磷酸酶)常用。按照制造商的说明操作。

2.通过凝胶纯化分离插入物和载体

现在，你已经切割了插入和载体，不幸的是，你不能只是把消化混合物扔在一起。你需要把你的插入物和脊椎骨与用来消化它们的酶以及从它们身上切下来的任何部分分离出来。一种简单的方法是凝胶净化。在凝胶提纯过程中，你利用凝胶基质(通常是琼脂糖)上的电压差将带负电荷的DNA拉过凝胶。如图所示左，你消化的DNA（和未消化的对照物）被装入凝胶顶部的孔中，孔朝向阴极（-电荷）。当在凝胶上施加电压时，DNA向阳极迁移（+电荷）。线性化DNA的较大片段比较小的线性化片段迁移较慢。通过不同的迁移速度，您可以将主干从任何从主干上切下的插入物中分离出来，将新插入物从任何从主干上切下的突出物中分离出来；在凝胶运行一段时间后，这些不同大小的碎片将位于不同的位置，并且可以从凝胶中单独切割出来。

有多种方法可以可视化凝胶中的DNA(此表不包括所有凝胶染色):

有关这些污渍的更多信息，请参阅一口体积生物的博客以及相关制造商的网站。

这些污渍要求您在运行样品后对凝胶进行染色，或在凝胶制作过程中添加染色剂(上表中运行后或运行前)，分别)。上面的一些污渍需要你使用紫外线来观察你的DNA -请注意，紫外线会损害DNA，当使用紫外线观察时，应该佩戴适当的个人防护装备，因为它会对眼睛和皮肤造成损害。

当使用凝胶进行净化时，重要的是要有漂亮的松脆的带，并有空间来裁剪带。因此，我们建议您使用宽的凝胶梳，在较慢的一侧运行凝胶，并在样品之间跳过通道。除了DNA阶梯标准，如果你的消化不像预期的那样，运行每个质粒的未切割样本来帮助排除故障也是一个好主意。

一旦你切割和纯化了你的插入和受体质粒骨干带离开凝胶通过你喜欢的凝胶纯化方法，是重要的测定回收DNA的浓度因为这对结扎步骤是有用的。

3.连接您的插入到您的向量

在结扎步骤中，将纯化后的骨架混合在一起，将其插入到单个试管中，使限制性消化产生的可兼容的悬垂物相互退火，形成一个完整的圆形质粒。然后加入DNA连接酶，以共价键的方式将这些片段连接在一起，而不需要ATP(请看下面，共价键用红色表示)。

我们建议在一个标准的连接反应中含有大约100ng的总DNA。理想情况下，“受体质粒:插入比”约为1:3。由于每个碱基对的数量不同，仅根据DNA浓度很难计算。一种方法是对你要创建的每个质粒进行2次连接，插入不同比例的受体质粒。

建立不添加插入DNA的阴性对照连接反应至关重要。这将允许您确定由于背景再循环和未切割质粒污染，在转化中您应该预期有多少菌落。

4.转型

使改变你的结扎反应进入你选择的菌株。为您的感受态电池遵循制造商的说明。

对于大多数标准克隆，你可以将1-2μl的连接反应转化为感受态细胞，如dh5 α或TOP10。如果使用更少的总DNA (<1ng)或如果你有困难获得菌落，你可能想要使用更高的能力细胞。另外，如果你的最终产品非常大（>10kb）您可能希望使用电活性电池，而不是更常见的化学活性电池。

在结扎之后，你应该至少执行两个转换:

1.含单骨干结扎混合物的控制变换;

2.包含带有插入物和主链的连接混合物的转化。

下面显示了指示成功和不成功结扎的样本结果。成功的连接将在主干单独板上有少量菌落，在主干+插入板上有许多菌落（或至少比主干单独板上有更多菌落）。不成功的连接通常会导致两个平板上的菌落数很少（不成功1），在一个单独的载体平板上的菌落数比载体+插入平板（不成功2）的菌落数多，或者在每个平板上的菌落数大致相等（不成功3）。

如果你的骨干板上有大量的菌落(大于或等于骨干+插入，u如上述2和3)，你可以尝试在连接酶存在和不存在的情况下单独连接受体质粒。如果菌落是未切割的空质粒的结果，那么在不添加连接酶的情况下仍会有菌落。如果菌落是受体质粒自连接的结果，添加连接酶后，你会看到明显更多的菌落。

如果您没有看到任何殖民地，您应该进行积极的控制，以确保您的转换工作。你还应该确认你是在适当的抗生素和尝试改变“受体质粒:插入比在连接反应中。

5.纯化质粒

一旦看起来你的结扎成功了，你就需要挑选单个细菌菌落并检查它们是否成功结扎。根据对照板上的背景菌落数量选择3-10个菌落（背景越多，需要选择的菌落越多），并培养过夜用于DNA纯化。你能做的最简单的纯化是miniprep，但如果你需要更多的DNA，你需要做midiprep或maxiprep。在这些纯化过程中，你通常会分解细菌；加入化学物质沉淀出高分子量基因组DNA；通过结合质粒DNA的柱过滤剩余质粒DNA，并让其他材料通过；最后，使用特定的缓冲液或水从柱上选择性地洗脱质粒DNA。有关更多详细信息，请参见柱制造商。发现columnless净化协议在我们的网站上．

6.验证了质粒

后净化DNA,进行诊断限制消化100-300ng的纯化DNA和用于克隆的酶。在计算机上运行您的摘要琼脂糖凝胶．你应该看到两条带子，一条和你的脊椎骨大小一样，另一条和你的新插入物大小一样(见右图)。如果你只使用了一种酶或使用了具有兼容悬臂的酶进行结扎，那么你将需要验证插入的方向。您可能需要为此目的设计一个诊断摘要。

理想情况下，一旦你知道你的质粒有一个适当大小的插入物，你应该用允许你阅读插入物的引物把它送去进行sanger测序。查看我们的帖子如何验证你的质粒更多细节。

一旦你的完整质粒得到验证，你就可以开始实验了！

额外的资源:

• 阅读有关凝胶污渍的文章BitesizeBio博客

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• 学习如何验证你的质粒
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