如果克隆方法具有个性，那么SLIC（序列和连接独立克隆）将是一个真正的反叛者。该系统不仅不使用位点特异性重组，也不需要连接步骤！基于在大肠杆菌，SLIC是一种廉价、标准化、快速的多部分DNA组装方法-请继续阅读，了解如何在研究中使用它。
起点：不依赖连接的克隆
Ligation-independent克隆(LIC)最初是在20世纪90年代开发的。传统的限制性内切酶克隆使用短而粘稠的末端，而LIC利用T4 DNA聚合酶的外切酶活性，创造出约10-12个碱基的更长的“嚼背”悬垂物。只有一种类型的dNTP会出现在反应混合中，将外切酶活性限制在该核苷酸的首次出现。在这个位置上，T4会进行有利的聚合酶反应，随后由于缺乏其他dntp而停止。载体和插入物一旦分开消化，就可以退火，形成具有四个刻痕的圆形产物，易于细菌转化后修复。
LIC是一种可靠的克隆方法，但受其序列限制。10-12碱基悬挑不得含有反应中存在的dNTP，否则会在该位置发生聚合，防止T4咀嚼整个10-12碱基。因此，LIC的使用通常仅限于特殊设计的质粒。
序列和连接独立克隆:SLIC改造
2007年，LIC得到了一个重要的更新，由Addgene depositor提供斯蒂芬·埃利奇．他的新方法，命名为序列和连接独立克隆(SLIC)，消除了LIC的许多限制。SLIC的关键是同源重组的力量。在大肠杆菌，一种健壮的同源重组系统允许基于序列同源区域修复间隙和悬垂。这一过程可以通过以下两种途径之一发生:reca介导的重组或不依赖reca的单链退火。Elledge意识到，他可以通过PCR生成不完美的“重组中间体”和不精确的T4外切酶活性，克服了LIC中使用的精心设计的DNA悬臂的要求。只要有足够的序列同源性(20-60 bp)来组织片段并将它们结合在一起，大肠杆菌能够“修复”质粒，产生重组DNA。将纯化的RecA添加到转化前孵育中，增强了修复过程，允许SLIC与非常少量的DNA(如3 ng)一起使用。当使用大量的DNA (~100 ng)时，不需要RecA。
SLIC的实用性
为了启动SLIC克隆过程(见上图)，通过PCR扩增一个感兴趣的片段，添加指定的5 '和3 '同源区域。该PCR片段和线性化的质粒均在没有dNTPs的情况下用T4聚合酶部分酶切。在第二步中，加入一个dNTP终止外切酶反应。PCR片段与质粒结合，退火，转化大肠杆菌. 为了让事情变得更简单，SLIC还与不完全合成（iPCR）片段兼容（上图右分支）。如果PCR不包括最后的延伸步骤，由于延伸不完全，许多产物将具有单链悬垂，并且这些片段可以诱导重组。混合PCR，显示在上述图的中间分支，也可以用来创建插入物。两个PCR产物用于产生具有5'或3'突出部分的目标基因。当产物被混合和退火时，25%的DNA将有两个单链悬垂，可以有力地刺激重组。
SLIC是多组分组装的理想选择（参见下图），因为重叠序列同源性指定了多个片段的顺序，并且组装是无疤痕的。对于40 bp的同源区，五段组装反应是高效的（~80%），十段组装也可以成功，但效率较低（~20%）。
SLIC与其他克隆方法相比如何？
SLIC的局限性来自于它对单链悬垂物的依赖。这些悬挑必须是可接近的，以允许互补碱基配对，所以如果悬挑具有稳定的ssDNA二级结构，SLIC就不能使用。一个常见的例子是转录终止子的茎环结构。另一个潜在的问题是序列相似性。如果多组分组装中的片段相互之间有5 '或3 '序列同源性，则可能组装错误。为了克服这个限制，一种选择是执行分层组装，在多个步骤中组装片段，以避免在同一反应中使用多个具有相同同源性的片段。在这些情况下，使用另一种克隆方法，如金门组装，也可能是有益的。
SLIC最常被比作吉布森组件，另一种基于同源重组的克隆方法，将在即将发布的质粒101文章中进一步详述。Gibson组装需要T5核酸外切酶与Phusion聚合酶和DNA连接酶结合，而不是使用T4 DNA聚合酶。这种反应发生在一个步骤而不是SLIC所需的两个步骤中，连接酶可以提高多部分组装的效率。Gibson组装发生的较高温度也可能限制碎片末端二级结构的形成。与Gibson组装相比，SLIC的主要优势是成本，因为T4聚合酶比Gibson组装所需的酶便宜得多。
SLIC是一种标准化的多片段DNA组装方法，成本低，是研究人员进行大量克隆的理想方法。与Gateway克隆不同，组装是无疤的，而且该方法的灵活性允许它用于不同类型的pcr生成插入。通过利用DNA修复的力量大肠杆菌，您可以组装多个片段，而无需特定的限制性位点或DNA连接酶！
工具书类
1.通过SLIC在体外利用同源重组产生重组DNA。李茂忠，Elledge SJ。2007年3月;4(3):251-6。Epub 2007 2月11日。PubMed。
2.SLIC：一种不依赖于序列和连接的克隆方法。李美滋，Elledge SJ。方法采用分子生物学方法。2012;852:51-9. 内政部：10.1007/978-1-61779-564-0_5。PubMed。
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