拓扑异构酶基克隆(TOPO克隆)是一种DNA克隆方法不使用限制性内切酶或连接酶，不需要pcr后程序。听起来很简单吧?该技术依赖互补碱基对腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)杂交形成氢键的基本能力。这篇文章的重点是“粘端”TOPO(也叫TOPO- ta)克隆;然而，TOPO克隆技术也适用于钝端克隆。
那么，TOPO克隆是如何工作的呢?
如下图所示，蓝色PCR产物插入物上的“A”来自于扩增步骤使用Taq聚合酶，因为Taq聚合酶会在PCR产物的3'端留下一个脱氧腺苷(A)。这对中互补的“T”来自拓扑异构酶i -线性化的主干。DNA拓扑异构酶I(描述为绿色云团)既具有限制性内切酶的功能，又具有连接酶的功能，它通过切割和重新连接超螺旋DNA末端来促进复制。
TOPO技术特别使用牛痘病毒分离的拓扑异构酶I，因为该酶识别DNA序列5´-(C/T)CCTT-3'，并在此序列上酶切双链DNA。断裂产生的能量以共价键的形式储存在被切割的3 ' DNA链和拓扑异构酶I (1）.如果来自不同DNA链的5 '羟基出现，它可以攻击这个共价键，从而连接两个DNA链并释放拓扑异构酶(2）.
如今，市面上可买到的TOPO试剂盒提供了带有悬垂3´脱氧胸腺嘧啶(T)残基的载体或克隆臂，这些残基共价连接到拓扑异构酶。这些试剂盒中的载体也经常将拓扑异构酶位点插入-半乳糖苷酶盒中，以便研究人员进行操作蓝白色的筛选后转换-载体末端的自我连接导致蓝色菌落的生产，不需要采摘和测序潜在的阳性克隆。一旦您引入您的3 '端“A”悬垂插入，拓扑克隆的魔法就发生了。
基本程序
让我们来分解TOPO克隆所需的步骤:
1.创造你的PCR产品:设计标准引物(不需要在末端添加独特的限制性位点)，并使用您喜欢的PCR协议用Taq聚合酶扩增您感兴趣的序列。
2.建立TOPO克隆反应:将PCR产物与TOPO载体混合。
3.室温孵育5分钟如果你打算立即转化，你可以把反应放在冰上，或者你也可以把反应储存在-20摄氏度过夜。
4.将TOPO克隆反应转化为感受态细胞:你可以使用标准的实验室协议;但是，您应该将在冰上的孵育时间减少到5分钟(完全孵育30分钟不会显著提高转化效率)。
5.选择和分析10白色或浅蓝色殖民地：你可以通过PCR来确认插入物的存在，限制消化,或测序．
专业技巧
- 不要在PCR引物中添加5 '磷酸盐;你需要自由的羟基!
- 您可能希望在最后一个PCR循环之后增加额外的时间，以确保“A”被添加到所有PCR产品中。
- 请记住Taq聚合酶的错误率约为1 / 3500个碱基。通常使用具有校对功能的聚合酶来代替Taq，以减少错误率;然而，校对聚合酶也将删除PCR产品中所有未配对的3 '端。如果您需要减少错误率，请使用以下方法之一，以确保您的插入保持3' A悬垂:
- 使用校对酶和Taq的混合物，Taq的使用比例超过10:1。
- 凝胶净化您的PCR产品与缓冲液、Taq和dATPs在72C条件下孵育10-15min。
- 当PCR产物与TOPO载体混合时，你可能想要在反应中添加额外的盐:
当PCR产物与载体连接时，拓扑异构酶I从载体中释放;然而，它可能会重新结合并划伤新连接的DNA。盐有助于防止拓扑异构酶I重新结合，从而产生更完整的分子。(请注意，你添加的盐的数量将取决于你是否计划将你的反应转化为化学反应或电反应大肠杆菌-过量的盐导致电穿孔电弧，这将导致电穿孔失败)。
- 在室温下孵育时，不建议超过5分钟的时间限制(有报告称，孵育时间越长，转化效率越低);然而，如果你的PCR产物浓度很低，或者你正在克隆一个非常大的插入物，你可能需要孵育20-30分钟。
- 由于标准的结扎反应是相当快的，确保你保持组织和准备一切你需要的下一个步骤之前进行。
- 在你的转化之前预热你的含抗生素的培养皿，可以让你在8小时内看到菌落。
引用:
1.舒曼。由痘苗病毒DNA拓扑异构酶I介导的大肠杆菌重组具有序列特异性。美国国立科学院科学研究所1991年11月15日,88(22):10104 - 8。PubMedPMID: 1658796．公共医学中心PMCID: PMC52876．
2.利用牛痘DNA拓扑异构酶进行分子克隆和多核苷酸合成的新方法。舒曼S. J Biol Chem. 1994 12月23日;269(51):32678-84。PubMedPMID: 7798275．
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