金宝搏app下载荧光蛋白101:亚细胞结构和细胞器的可视化

与器官组成的人体相同的方式，细胞包括隔室和结构，称为细胞器。在细胞内拍摄潜行峰值来自艾伦细胞探测器的图像（1)．

当研究蛋白质的功能或其在疾病中的作用时，研究人员经常分离感兴趣的蛋白质，并使用生化方法检查它们，从而消除细胞的背景。然而，通过了解蛋白质在活细胞中的位置和运输，可以获得许多关于功能的知识。分析健康和疾病状态之间蛋白质定位和转运的差异也可以为疾病机制和蛋白质功能提供有趣的见解。

准备确定你感兴趣的蛋白质的亚细胞定位

分析你感兴趣的蛋白质定位的第一步是让它可以被检测到。荧光显微镜可以实现可视化——甚至在活细胞和整个有机体中。您可以利用许多荧光蛋白(FP)可用于显微镜，克隆您感兴趣的蛋白质进入金宝搏app下载编码荧光标签的向量．一旦表达为荧光蛋白融合，可以从其生产现场跟踪您的利益蛋白质到最终目的地。作为一个例子，大多数分泌的蛋白质在内质子网中产生，在GOLGI中改性，然后通过分泌途径在亚细胞或细胞外目的地中在囊泡中运输。在其生命周期结束时，蛋白质可以通过囊泡输送到溶酶体，在那里它们最终降解（2，3.)．

一旦创造了融合蛋白，重要的是验证其相对于未标记的野生型蛋白质的功能。例如，您可以通过将来自融合本身的信号与荧光标记的抗体观察的野生型蛋白质比较来验证融合蛋白定位的融合蛋白定位。

通过使用已知是细胞器的一部分或参与细胞内运输途径的“标记蛋白”，就有可能绘制细胞的内部组织。这种定位可以通过使用针对标记蛋白的抗体来完成，然而，在这种情况下，为了让抗体达到细胞内的目标，细胞需要被固定，细胞膜需要渗透。因此，用FPs标记的特征明确的标记蛋白来突出各种亚细胞结构是有益的。请参见图1哺乳动物主要细胞器和运输途径的常用标记．

最好的方法是使用惰性荧光蛋白融合来观察亚细胞结构，尽管这并非总是可行的。例如，你可以将荧光蛋白融合到信号序列中，将荧光蛋白传输到你感兴趣的细胞器中。

点击下图中的基因名称，找到含有该特定基因的质粒。

酵母中的亚细胞标记见我们的质粒收集苏Jaspersen((Stowers研究所)和马克·普雷斯科特(莫纳什大学)。

你可以找到更多的质粒来标记你感兴趣的亚细胞结构艾伦细胞科学研究所质粒收集．你也可以用the斑马鱼拉布蛋白全长文库来自Rob Parton的实验室(昆士兰大学)，以观察膜贩运事件体内。

定位你的蛋白质，通过共定位，看看它和谁在一起——也就是“他们亲近吗?”

在标记了你感兴趣的蛋白质和选定的亚细胞标记蛋白后，就有可能了解你的蛋白质所在的亚细胞结构，以及它可能与哪些其他蛋白质形成复合物。这些“共定位”研究提供了关于在相同亚细胞结构或蛋白质复合体中的两个蛋白质的接近性的见解。通过共同表达标记蛋白和感兴趣的蛋白，然后分析它们的荧光信号的相对共定位和潜在重叠，有可能确定蛋白质在复杂结构中的位置。

为了科学而有意义地解释共本土化实验，选择合适的量化方法和工具是非常重要的。通过简单的“看”来进行主观判断通常是不够的。现代相机和图像分析软件对探测人眼不可见的光信号高度敏感，对主观色彩强度感知不感兴趣。开源图像分析软件工具可用于共本地化分析。一些例子包括ImageJp林林JACoP和Coloc 2，BioImageXD和定制的CellProfiler管道。图像分析软件产生可量化的结果和统计数据，可用于比较不同的实验设置。

图2给出了一个共本地化分析示例(改编自4） -Dunn等人。2011年提供了对定量分层化分析方法和有用的图像分析软件工具的深入综述。

缺陷、限制和专用的本地化方法

金宝搏app下载荧光蛋白是非常有用的工具，但它们并非没有限制，而且需要良好执行的实验FP性质的一些考虑。这是很重要的与荧光成像相关的一般问题例如漏透(在通道设置中对不同荧光信号的一个荧光信号的错误检测)和光漂白即FP稳定性。

还应意识到与FPS本身的属性有关的其他问题。这些可以包括寡聚的可能性一个大的或带电的FP融合可能会改变一个感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。为了避免这些问题，科学家们不断地更新和优化FP工具。看，例如，最近发展的FPs优化了不同的细胞环境．

由于分开的依赖于检测2个独立荧光信号及其潜在重叠，因此必须确保所选择的FPS不会彼此影响，因此可能伪造信号。作为基线规则，选择所选FPS的发射光谱需要充分分离，最常见的是具有红色和绿色波长的FPS（6)．这些之前的博客文章帮助您决定应该使用哪个FP以及如何选择FPs进行多色成像．

此外，人们必须记住，光学显微镜的分辨率受到光波长的限制，实际上，普通实验室显微镜的检测限是200 nm。大多数蛋白质的大小小于10 nm，因此在显微镜下检测到的共定位不能被解释为直接的分子相互作用，除非进一步研究。一种常用的荧光显微镜方法用于更紧密地分析两个分子之间的相互作用是Förster共振能量转移，烦恼．

额外机会:追踪细胞内病原体

除了跟踪蛋白质的位置，还可以跟踪病毒和细胞内细菌的生命周期——看看我们的微生物学资源用于荧光标记的病毒和细菌成分例如,Mariette Barbier实验室的彩虹向量可用于荧光标记各种各样的革兰氏阴性细菌（西弗吉尼亚大学医学院，7)．

确定亚细胞定位和细胞复合物的组成是理解你感兴趣的蛋白质在健康或病变细胞中的功能的重要步骤。我们希望您发现本文中讨论的资源对您的下一个定位实验有用，并邀请您将您在自己的工作中创建的任何荧光蛋白结构提供给Addgene社区。

下载我们的标记亚细胞定位海报在这里!

参考

1.艾伦研究所质粒页

2.库珀通用。2000。《细胞:分子方法》第二版．

3.CureFFI.org。细胞生物学04:分泌途径．

4.Dunn, Kenneth W.， Malgorzata M. Kamocka和John H. McDonald。“在生物显微镜中评估共定位的实用指南。”美国生理学杂志-细胞生理学300.4 (2011): C723-C742。PubMedPMID: 21209361．公共医学中心PMCID: PMC3074624．

5.等。mScarlet:一种用于细胞成像的明亮单体红色荧光蛋白。自然方法14.1(2017): 53-56。PubMedPMID: 27869816．

6.媒体控制论。荧光探针的共定位．

7.Barbier Mariette和F. Heath Damron。“用于广泛细菌荧光标记的彩虹载体”。《公共科学图书馆•综合》11.3 (2016): e0146827。PubMedPMID: 26937640．公共医学中心PMCID: PMC4777285．

进一步的阅读

• 显微镜。使用荧光蛋白时的一般注意事项金宝搏app下载．
• Ruusuvuori, Pekka等。活体生物荧光样品中动态关联的定量分析《公共科学图书馆•综合》9.4 (2014): e94245。PubMedPMID：24728133．公共医学中心PMCID: PMC3984138．
• 显微镜。褶皱显微镜的基础知识．

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