质粒101:酵母载体

在我们最初的几个质粒101篇文章中，我们主要关注在一个大肠杆菌细胞，但载体可以广泛应用于许多不同类型的细胞，每一种细胞都需要不同的载体传播元素。这篇文章，以及以后的一篇文章哺乳动物载体的核心复制和抵抗特性酵母向量并解释它们与前面描述的细菌成分的区别。

科学家为什么使用酵母载体？

酵母是真核生物，因此包含与动植物相似的复杂内部细胞结构。与细菌不同，酵母可以翻译后修饰蛋白质然而，它们仍然拥有许多与原核生物相同的技术优势．这包括但不限于:快速生长，易于复制电镀和突变体分离，定义良好的遗传系统，和高度通用的DNA转化系统。与大多数其他微生物不同，酵母具有稳定的单倍体和二倍体状态，这有助于遗传分析，并且具有高效的同源重组机制以促进简单的基因替换/突变．在实验室中使用的酵母表达质粒通常包含所有必要的成分，以允许在两者之间穿梭大肠杆菌和酵母细胞。为了在实验室中使用，载体必须包含酵母特异性复制来源（ORI）和酵母细胞中的选择方法，例如添加细菌ORI和抗生素选择标记．

酵母o复制的起源

(请注意:第一部分主要是关于出芽酵母中的ORIs，酿酒酵母; 然而，我们也注意到了裂变酵母复制所需的一些特性，波姆裂殖酵母，最后是向量。）

在之前的一篇文章中，我们简要讨论了细菌ORIs的调控如何决定细菌细胞内的质粒拷贝数。同样，酵母载体中包含的特定ORI元素决定了质粒如何在酵母细胞中复制和维持。这些元素不仅控制每个细胞中质粒的数量，还控制质粒是否与宿主DNA整合或独立复制。酵母质粒的四种主要类型定义如下：

• 酵母整合质粒(YIp):这些质粒缺乏ORI，必须通过同源重组直接整合到宿主染色体中。
  
  
• 酵母复制质粒(YRp)：这些载体包含来自酵母染色体的自主复制序列（ARS）。顾名思义，这些载体可以独立于酵母染色体进行复制；然而，它们往往是不稳定的，可能在萌芽期间丢失。
  
  
• 酵母着丝粒质粒（YCp）：这些被认为是低拷贝载体，包含ARS的一部分以及着丝粒序列（CEN）的一部分。这些载体的复制就好像它们是独立的小染色体一样，因此通常被发现为单一拷贝。与ARS向量不同，CEN向量在没有积分的情况下是稳定的。
  
  
• 酵母Episomal质粒：这些与细菌质粒最为相似，被认为是“高拷贝”。来自2微米环的片段（一种天然酵母质粒）允许50多个拷贝在每个细胞中稳定传播。如果包括特定的可调节元件，这些向量的拷贝数也可以控制(这里回顾).

用于美国非洲酒另一方面，不需要定义良好的ORI。相反，DNA的大小和A-T含量（显然与已知的特定序列无关）决定了这些载体的复制。美国非洲酒质粒通常利用ARS来帮助提高转化效率;然而，该区域不一定促进复制。

酵母选择标记

从历史上看，科学家在使用酵母时使用营养缺陷选择而不是抗生素选择由于自发产生的抗性突变体和酵母菌对某些抗生素不敏感. 营养缺陷是指生物体不能合成生长所需的特定有机化合物。存在许多营养缺陷型酵母菌株，当在含有缺失营养素的培养基上生长时，这些菌株很容易保持。科学家可以利用这些宿主突变，包括一个补充宿主营养缺陷的功能基因副本。当在不含营养素的培养基上生长时，宿主细胞将死亡，除非它们加入了携带所需基因的质粒。

下表列出了酵母中一些最常用的选择标记，并提供了克服营养缺陷所需的元素以及这些元素的其他用途。这Link提供了一个更广泛的酵母营养缺陷标记的列表并包含相关的引用。

使用营养缺陷选择时的考虑

当然，使用营养缺陷标记作为选择手段也有一些缺点:

1. 一种特殊的选择标记需要用于缺乏这种化合物的酵母菌株。因此，必须在试验前利用已知的营养缺陷菌株/选择元件对或建立新的组合。
   
   
2. 由于高拷贝数，质粒提供的标记可能在高于正常生理水平的水平上表达。这给酵母细胞带来了潜在的代谢负担。
   
   
3. 由于选择标记在非生理水平上的存在，一些表型可能被改变。

科学家们尝试了多种方法来解决这些问题。减少标记基因表达量的一种方法是使用部分缺陷启动子来驱动选择标记的表达。这减少了细胞中存在的基因产物的数量，从而允许酵母保持较高的拷贝数。此外，抗生素选择的改进使得利用更传统的药物选择方法在酵母中作为营养缺陷标记的补充或替代可行。的MX系列抗生素耐药盒最常用的是抗性基因由于其多样性和用于细菌、酵母和哺乳动物细胞的能力，它是最普遍的。