最后一次更新于10月14日，2020年由Seth Kasowitz。
这篇文章的作者是艾伦细胞科学研究所的基因编辑团队。访问Allen Cell Explorer了解更多信息，网址为Allancell.org以及艾伦研究所的网站alleninstitute.org。
细胞生物学的一个经典挑战是确保我们通过显微镜观察到的东西尽可能准确地代表现实。这在用蛋白质标签来阐明细胞结构的情况下尤其如此。过度表达的方法会使细胞充满蛋白质，这既会干扰细胞的正常功能，也会导致无处不在的背景信号，这使得很难看到感兴趣的蛋白质或结构的精确位置。
内源性基因标记是一种理想的解决方案，因为它允许在内源性调节控制下标记和可视化特异性单个蛋白质。但即使是出现CRISPR/Cas9技术然而，将大标签插入基因组中的精确位置仍然效率低下，特别是在人类细胞系中。此外，对于许多实验室来说，确保编辑后的单元格正常运行所需的质量控制成本可能过高。
我们已经创建并测试了使用CRISPR/Cas9来用GFP对多种基因进行内源性标记。这些质粒可通过addgene获得，并且我们使用它们制造的干细胞系可作为其中的一部分提供科里尔艾伦细胞采集中心。可以在数据门户网站上的单元目录中找到从这些单元格生成的更多信息和图像。质粒应在许多不同的人类细胞类型中具有功能性，而我们标记的大部分基因是广泛认可的蜂窝结构标记，我们提供了如何在下面制作自己的基因标记结构的指导。请继续阅读，了解这些质粒如何工作，并为基因组标记实验发现更多资源。
荧光标记策略
创建质粒的第一步是确定感兴趣的基因，并决定标记哪个末端，N或C，以及使用哪个短氨基酸连接子。这些决定是基于从文献中收集到的蛋白质的已知功能方面以及与研究感兴趣的蛋白质或结构的研究人员的接触做出的如上面的例子所示，我们在基因最后一个外显子的末端插入了一个连接子和GFP标签，以确保它能够被转录和翻译。对于N端标记的蛋白质，我们使用了相同的策略，将标签和连接子插入到基因的第一个外显子之前。通过这种方式，我们创建了一个初始的set包含代表10个人类基因的10个质粒，今年晚些时候将增加更多。
设计供体质粒
我们的方法学的一个关键特征是使用供体质粒，该质粒在荧光蛋白序列的两侧都含有很长的DNA，该序列与插入的序列同源：事实上，每侧都有1000个碱基对。后来，当我们转染细胞时，这些大的同源区域使我们能够有目的地利用宿主细胞固有的同源性定向修复（HDR）在目标位置进行CRISPR/Cas9双链断裂后的工艺。整个片段——一个GFP标签和两侧各1kb的同源DNA（总长度约2.7kb）——被插入质粒主干中，以输送到细胞中。作为预防措施，在质粒同源区域内发现的crRNA靶点上进行一些单碱基对突变也很好，以防止质粒在转染过程中被CRISPR/Cas9切割和破坏。
通过同源定向修复实现双链断裂并引入标签
为了将荧光标签介绍给细胞，我们使用CRISPR / CAS9在臀部细胞的基因组中，在感兴趣基因的开始或结束附近的基因组中进行精确切割 - 在臀部细胞的基因组中。虽然基因组的大部分时间都会试图在没有外部影响力的情况下修复自己（非同源终端连接，或NHEJ）在大约一个百分之一的病例中，干细胞将寻找修复过程的模板。通过将细胞与含有切割的基因含有高同源性的质粒的细胞，我们将细胞诱使使用引入的供体质粒作为修复模板。这导致在本例中精确地插入GFP标签，在此示例中，在感兴趣的基因的C末端。得到分子CRISPR / CAS9的组件（CAS9蛋白和CRRNA-TracrRNA复合物）和供体质粒进入细胞中，我们使用电穿孔，这项技术简要地破坏了细胞外膜的技术，并允许组件物理地进入细胞，以便他们可以去上班。
质粒，到处都是质粒
要了解更多关于基因编辑的臀部细胞系，请使用Allen Cell Science Plasmid集合，请访问细胞目录艾伦细胞探索者，您还可以在那里找到每个单元线提供的分析证书。上述编辑策略和设计可用于创造类似的供体质粒，用于将标签引入您的感兴趣基因。
研究人员开发了各种内源性基因标记系统。addgene的基于CRISPR的蛋白质标记集合包括标记哺乳动物细胞系，果蝇细胞的系统，和C. Elegans.。除了产生荧光蛋白融合，可用于用表位标签标记质粒（例如旗帜和腕表）和纵向诱导尺度（援助）。此外，这是Yamamoto音调系统质粒提供HDR作为双链断裂修复途径的替代方案，依赖于微型学介导的终端连接（MMEJ）。
要了解有关使用这些质粒生成的基因编辑髋关节细胞系的更多信息，请访问细胞目录艾伦细胞探索者，您还可以在那里找到每个单元线提供的分析证书。上述编辑策略和设计可用于创造类似的供体质粒，用于将标签引入您的感兴趣基因。
本文所述的荧光蛋白内源性基因标记使活细胞成像能够研究细胞结金宝搏app下载构和过程，并有助于更好地理解细胞生物学。我们希望这些高质量、高度特异性的质粒，以及关于如何制作自己的质粒的说明，将使您更容易在实验中使用基因组标记。
非常感谢我们来自艾伦博物馆科学研究所的客人博客。
这篇文章是由Allen Cell Science研究所的基因编辑团队贡献。通过访问Allen Cell Explorer来了解更多信息Allancell.org以及艾伦研究所的网站alleninstitute.org。
工具书类
1。罗伯茨、布罗克等人。”系统基因在人干细胞中使用CRISPR / CAS9以照亮细胞组织."生物十四(2017): 123042.
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