聚合酶链式反应概述和应用

PCR的步骤

PCR的美丽是它可以仅使用短暂的试剂和几种加热和冷却步骤扩增DNA。PCR依赖于来自嗜热细菌的耐热DNA聚合酶，Thermos Aquaticus.（taq）。因此Taq聚合酶是一种耐热酶，能够承受温度的变化。聚合是第一次发现是在20世纪60年代末在黄石国家公园温泉的研究期间。

除了Taq DNA聚合酶之外，PCR还需要自由核苷酸（DNTPS），模板DNA从达到（5'）和下游（5'）和下游（3'）的感兴趣区域的下游（3'）的独特单链DNA引物。引物对于该方法至关重要，因为DNA聚合酶需要现有的DNA链以添加核苷酸。

利用这些试剂和一系列的加热(变性)和冷却(退火)步骤，Taq聚合酶可以利用dNTPs在引物之间复制DNA。

让我们跳入PCR反应的3个基本步骤的细节：

1. 变性-为了扩增DNA，首先必须将模板DNA的两条链分开。这是通过将dsDNA模板加热到碱基对之间氢键断裂的位置来实现的。这导致了两条DNA链的分离。
2. 退火- 然后将温度滴入前向和反向引物稳定的范围内。在此温度下，引物可以退出单链DNA模板股。DNA聚合酶在该温度下也稳定，并且可以与引物结合。
3. 延期-然后将温度略微升高到Taq聚合酶的理想温度（70-75^oC）。在该温度下，TAQ聚合酶可以快速，准确地合成并伸长靶DNA。

这个变性、退火和延伸的过程重复25-35次，以指数方式复制感兴趣的目标DNA。整个反应过去是在水浴中手动完成的，但现在很容易在程序热循环器中完成。要了解更多关于这个程序的细节，请查看我们的PCR协议页面，协议视频和参考如何设计PCR引物．

PCR的类型

自PCR发明以来，针对不同的科学应用发展了不同的PCR方法。这些PCR方法都使用相同的基本PCR设置和步骤，但在分析PCR产物的方式上有所不同。

终点PCR

终点PCR，顾名思义，分析PCR温度循环的最终产物。最终的PCR产物通常在a上可视化诊断琼脂糖凝胶确认产品存在，大小和相对数量。终点PCR最常用于分子克隆，测序和基因分型。它非常有用，但并不像其他PCR一样定量。理论上科学家应该能够在PCR反应后确定DNA的量，因为扩增子使每个反应循环加倍。然而，在最终循环期间，DNTP和其他试剂常常在最终循环中运行低，这会缓慢或停止PCR扩增。其他时间，PCR反应可能不是100％效率，并产生减少量的产物。

终点PCR通常被称为简单PCR，用于一系列不同的分子生物学技术和实验。终点PCR的目的是扩增一个特定的DNA靶点。这种放大器可用于分子克隆以产生感兴趣的质粒，用于检测样品中是否有插入物或DNA片段殖民地PCR.，或产生突变序列定点诱变．

定量聚合酶链反应(qPCR)

也称为实时PCR的定量聚合酶链反应（QPCR）是用于测量使用PCR的开始DNA浓度的PCR技术。QPCR需要加入基于探针的荧光染料，其与任何DSDNA嵌入并使用内置在热循环仪中的荧光计特征以测量该荧光输出。利用这种荧光染料，通过荧光信号连续检测PCR反应循环期间DNA的浓度。该信号与每个循环产生的产品的量成比例地增加。

为了确定起始模板DNA的浓度，将整个反应过程中的荧光信号与已知起始浓度的扩增DNA的标准曲线进行比较。与标准曲线比较的未知DNA检测周期可以用来确定样品中起始物质的数量。

QPCR也可用于使用逆转录QPCR（RT-QPCR）定量RNA水平。该过程的第一步需要使用逆转录转化为CDNA的RNA，随后通过QPCR定量cDNA。QPCR用于各种应用，包括基因表达分析，研究拷贝数变异和分子诊断。

数字液滴PCR, ddPCR

数字液滴PCR或DDPCR是一种提供超细致敏和绝对核苷酸浓度的方法，与QPCR不同，其中结果可以在重复上变化。DDPCR可用于量化例如罕见的DNA序列，例如罕见的等位基因或突变。DDPCR还不需要参考或标准曲线，这可能是耗时和挑战以实现正确的。DDPCR使用水油乳液液滴技术，将PCR反应样品分数分为约20,000滴。每个液滴含有PCR扩增所需的材料。在PCR反应之后，通过液滴读取器分析每个液滴，其测量每个液滴的荧光幅度。测定荧光PCR阳性液滴的级分，然后使用泊松统计分析以确定样品中原始模板DNA的浓度。

Addgene目前使用DDPCR进行AAV滴定。您可以为AAV滴定学习所有关于DDPCR的DDPCR，并在博客帖子中找到有用的提示和技巧“AAV量化的液滴数码PCR。”

多重聚合酶链反应

多重PCR顾名思义，就是在一次PCR反应中，利用多个引物在一次PCR实验中扩增出多个靶标的方法。这是一种非常有用的PCR方法，可以帮助节省实验室的时间和精力。

多重PCR主要有两大类:

• 单模板PCR反应- 使用几个正向和反向底漆组放大一个模板。

• 多个模板PCR -一种具有与每个模板的目标区域对齐的不同引物对的多个模板用于一次反应。

多重PCR通常用于疾病或病原体的鉴定。科学家们可以同时在一个标本中检测出几种不同的病原体，既省时又省力。科学家也可以利用多重qPCR量化一个样品中多个起始DNA模板的浓度．然而，值得注意的是，多重PCR的发展更加复杂，而且往往比使用单一引物的PCR更不敏感，如上面所述的。多重PCR也被用于高通量SNP基因分型、基因缺失分析和RNA检测。

PCR类型的概述

PCR的类型	PCR方法的目标	PCR方法的应用
终点PCR或者只是PCR	放大兴趣区域	分子克隆 定点诱变 分子诊断
qPCR	量化开始模板DNA浓度	基因表达剖析 复制编号变体 量化RNA水平 分子诊断 NGS图书馆准备QC
DDPCR.	测定起始物料的超灵敏和绝对核苷酸浓度	AAV滴定 等位基因变异 量化低丰度目标 监测靶DNA水平的细微变化
多重聚合酶链反应	从一个样本中扩增多个目标	疾病或病原鉴定 SNP基因分型 基因缺失分析 RNA检测

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引用和资源

参考

• Shen C-H(2019)核酸扩增。常见于:诊断分子生物学。爱思唯尔,页215 - 247

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• 质粒101：菌落PCR
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