在Addgene的科学支持团队工作，我看到了一切质粒可能会出错。我帮助解决的最常见的问题之一涉及到重复序列的病毒载体和质粒。188完整比分直播质粒内重复序列可以进行分子内DNA重组。这一自然发生的过程是由重组酶介导的，如细菌中的RecA和RecBCD。当两个重复元素彼此非常相爱经过重组，形成两个较小的质粒。
188完整比分直播病毒载体容易重组
在慢病毒载体中，188完整比分直播重组通常发生在长末端重复序列(ltr)之间。重组后，一个质粒携带目的转基因(即病毒基因组)，另一个包含细菌选择标记和复制起源。在细菌培养过程中，只有携带抗生素抗性基因和起源的质粒会复制，转基因会丢失。随着时间的推移，含有重组载体主干的细菌也会超过含有全长质粒的细菌。
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| 图1:完整的慢病毒质粒预计为>12 kb。然而，如果它在5 '和3 ' LTR区域重组，它分裂成两个更小的质粒。约3.7 kb的重组载体骨干包含抗生素抗性基因(AmpR)和允许其复制的复制源(ori和f1 ori)。 |
我如何防止我的样品的重组?
质粒重组可影响病毒载体(ltr和itr)、具有多个polyA位点的188完整比分直播质粒以及其他含有重复成分的质粒。知道如何扩增具有重组倾向的质粒并测试你的准备，可以为你省去对失败实验进行故障排除的麻烦。
选择正确的菌株
而常见的大肠杆菌像DH5-alpha这样的菌株是recA -在美国，一些菌株已被改造以进一步减少重组。像Recombinase-deficient菌株Stbl2, Stbl3和NEB稳定大肠杆菌降低样品的复合率。
要了解这些克隆菌株的更详细的比较，请浏览我们的常见基因突变表质粒101:普通实验室E．杆菌菌株博客文章。在重新审视自己之前，先审视自己。
优化生长条件
为了减少重组，重要的是不要在37℃下过度生长质粒。一些研究人员发现使用30°C孵化温度让细菌生长得更慢有助于降低重组的风险。在质粒网页上寻找“细菌中的生长”部分，以获得沉积实验室的任何具体建议。
如果您的向量较大(>10 kb)或具有较低的拷贝数，请尝试执行以下操作低拷贝质粒协议．例如，使用较长的生长周期(可达24小时)，降低抗生素的浓度(如。50 μg/mL Amp而不是100 μg/mL Amp)，或使用更富营养的培养基可提高生长和DNA产量。
测试多个小的菌落
在LB琼脂板上划线后，你可能会注意到有大大小小的菌落。含有重组产物的细菌往往生长得更快，所以我们建议选择较小的菌落，它们更可能携带完整的质粒。查基斯和埃斯波西托(2018)注意到在带慢病毒载体的Stbl3细菌培养中，扁平的白色菌落包含完整的质粒，而圆形的棕色菌落看起来与正常188完整比分直播的类似E．杆菌培养物包含重组的载体主干。
在保存一个甘油存量之前测试多个菌落，以确保你选择的菌落包含完整的质粒。一个诊断消化是确定你的样本是否重新组合的最简单、最清晰的方法之一。选择一种限制性内切酶，它会给你不同的重组载体骨架和全长质粒的带型。如果你发现你的细菌培养中混合了完整的质粒和重组的载体骨架，你可以尝试重新标记单个菌落并测试多种准备物。在某些情况下，我们建议凝胶提取分离完整的质粒。请参阅我们的凝胶萃取协议为更多的细节。
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| 图2:一个未切割的质粒可以形成3条带:缺口带、线状带和螺旋状带。在这里，我们发现了一个更小的重组质粒，约1.5 kb。用BamHI切割时，可以看到预期的线性质粒，但重组质粒仍然可见。这表明，DNA准备包含完整的质粒和更小比例的重组载体主干的混合物。 |
准备,设置,成长!我们的排除病毒转导的5个技巧将有助于接下来的步骤。
引用和资源
参考文献
Al-Allaf FA, Tolmachov OE, Zambetti LP, Tchetchelnitski V, Mehmet H(2012)在大肠杆菌Stbl3中具有不稳定性倾向的慢病毒载体质粒的显著稳定性。3生物技术3:61 - 70。https://doi.org/10.1007/s13205-012-0070-8
Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C(2019)分段聚(A)尾显著降低了质粒DNA的重组，但不影响mRNA翻译效率或半衰期。RNA 25:507 - 518。https://doi.org/10.1261/rna.069286.118
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