劳力病毒所有东西的快速指南

如果您有兴趣使用慢病毒载体188完整比分直播要将您最喜欢的基因介绍进入您最喜欢的细胞系或进入主要单元格，这篇博客文章将为您提供一些提示，以使用慢动动力矢量系统计划实验。

188完整比分直播病毒载体自上世纪90年代初首次用于基因改造原代细胞以来，在基础和应用研究中越来越受欢迎。在使用的不同载体中，慢病毒载体结构被证明非常有用，因为它们能够感染分裂和非分裂细胞，包括干细胞．这些属性使致使致命的传染媒介提供奇妙的交付选择188完整比分直播成分，CRISPR / Cas9组件和荧光传感器．

逆转录病毒矢量背景

直到病毒载体的发展，基因转移到哺乳动物细胞中经常依188完整比分直播赖于化学物质（CaCl₂如阳离子脂质体)或电性(电流形成膜孔)转染．这些技术仍在使用，并能有效地将质粒DNA转移到永生细胞系中，但在将DNA转移到原代细胞或非分裂细胞时达到了极限。为了靶向这些不可转染的细胞，实验室使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，因为它们靶向的细胞范围更广，188完整比分直播它们与基因组的整合更有效。

使用的第一个逆转录病毒载体来自188完整比分直播Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，由两个质粒组成:The包装质粒含有生产病毒颗粒（GAG，POL，TAT，REV和EV）和编码感兴趣插入的转移质粒以及将其插入到病毒颗粒中所需的序列所需的所有结构基因（包装信号psi）。因为包装质粒缺乏PSI信号，所以编码结构蛋白的基​​因不能整合到新的病毒颗粒中，并且产生的病毒颗粒无法复制。然而，母亲自然发现一种重新创造功能病毒的方法。实际上，通过测试几个载体和包装细胞系组合，Miller等人。表明，在通过将逆转录病毒转移到包装细胞系PA12（含有PSI缺失）产生的高滴度逆转录血液中产生传染性野生型病毒。载体质粒和包装质粒之间的双交叉事件导致PSI序列置于形成可以产生复制态病毒的载体的包装质粒上。尽管该系统在将目的基因转移到适当的细胞时是有效的，但显然其安全性是缺点，特别是对于临床发展。此外，MOMLV在感染非分裂细胞时效率低，因此研究人员旨在创造更好，更安全的系统。

不像MoMLV，慢病毒，一个单独的属Retroviridae包括人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，可以感染分裂和非分裂细胞。T感染非分裂细胞的能力并不局限于体外细胞培养作为慢病毒衍生的载体能够转化某些静脉或终端分化的细胞，例如巨噬细胞和微胶质细胞。这家属性使Lentivirus成为基因转移载体的有吸引力的选择。

慢病毒载体188完整比分直播

虽然逆转录病毒仍在使用中，但由于其感染非分裂细胞的能力，人们在开发有效和安全的hiv -1来源的慢病毒载体方面做出了相当大的努力。188完整比分直播因此，到目前为止已经建立了三种不同的慢病毒载体，每一代的安全性都在增加。188完整比分直播

• 的第一代1)由野生型5′188完整比分直播和3′ltr组成的慢病毒载体基因组，ψ序列，包含rev响应元件(RRE)的env基因的一部分，一个内部启动子，以及所需基因(转移载体质粒)，2) HIV-1基因组包含除env基因(包装质粒)外的所有病毒基因;3)水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，提高所产生的病毒颗粒的稳定性并扩大其细胞趋向性。然而，在这个载体生产系统中，仍然存在复制能力慢病毒(RCL)的产生的潜在风险，特别是如果你正在从临床研究HIV阳性的人类细胞。

• 的第二代与第一个相似，只是移除了对慢病毒粒子的产生不是必需的HIV附属蛋白。这一代比第一代更安全，可以在研究实验室常规使用。产生RCL的风险很低，但必须格外小心，特别是如果你使用原癌基因或未经艾滋病毒检测的人类样本。如果不使用适当的技术，研究人员总是有很小的机会用致癌病毒感染自己，或者HIV阳性细胞中的附属因子可以使病毒有能力复制。
  

• 的第三代慢病毒载体是为了188完整比分直播在临床环境中安全使用而开发的。在这一代中，HIV Tat基因(以前用于驱动ltr的表达)被移除，Rev(促进核输出)从单独的质粒中表达，5’ltr的启动子被删除以降低其活性。一个CMV或一个EF1α启动子被插入到这个LTR中，所以在产生细胞时，你不需要Tat来转录病毒基因组。目前，第三代慢病毒载体系统在RCL生成方面提供了最好的安全性，因为该载体只需要3个HIV-1基因(gag、pol和rev)来生产。第三代慢病毒载体可以用于研究和临床目的，但提188完整比分直播高这些载体的安全性仍是一个活跃的研究领域，因为与人类逆转录病毒的突变或重组可能导致RCL。

关于转导功效，已经显示了第2和第3代的第3族之间的差异。但是，在第3代中，您可以获得较低的病毒滴度而不是第二代。了解这一点，您可以扩展生产设置并净化并浓缩您的慢病毒颗粒，以使其成为感染感兴趣的细胞的最佳集中度。

转移质粒

的转移质粒是你将感兴趣的基因克隆到的载体，也是你的实验的一个重要特征;必须谨慎选择。研究人员通常想要一个简单的设置，使感兴趣的基因与标记一起表达(荧光蛋白或者选择标记）允许选择转导细胞。在这种情况下，您的基因和标记物可以通过内部核糖体入口部位分离（忿怒）并在同一个启动子下表达。或者，您的基因和标记物可以在两个不同的启动子的控制下置于两种不同的启动子下。单一和双启动子转移载体都可以用于表达兴趣的基因，无论是组成的还是诱导的。如果您感兴趣的基因是有毒的，或者需要在细胞周期中表达某个点，则应使用具有诱导型启动子的转移载体（见下文）。

诱导的慢病毒转移载体

最广泛使用的诱导型慢病毒载体系统是四环素（TET） - 调节系统。您可以选择TET关闭系统或TET ON系统。在TET OFF系统中，TET响应元件（TRE）被放置在转移载体中的启动子的上游。在没有四环素或衍生物的衍生物如十二胞环素（DOX），TET控制的异椎灭菌剂（TTA也表达）与TRE结合并激活基因的表达。然后在文化中添加DOX将压制您的目标基因。该系统是有效的，但您必须意识到存在通常的背景活动，并且需要连续地管理DOX以压制转基因表达。相比之下，在TET上的系统中，TTA已被修改（并重命名RTTA），仅在DOX存在下绑定TRE。在这种情况下，您的基因以稳定状态抑制，并且当DOX添加到培养物中时表示。与TET-OFF系统相比，该系统现在显示出快速基因表达动力学。TET系统的一个缺点是它通常需要将两个不同的表达载体输送到靶细胞 - 一种含有感兴趣基因的细胞（pTet-IRES-EGFP，PPRIME-TET-GFP-FF3.)和带有tTA或rtTA (FUW-M2rtTA）.在这种方法中，一个细胞群可能只表达tTA或你的转基因，导致低诱导性，潜在地使你的结果难以解释。这可能是你的实验的瓶颈。含有你的转基因和tTA/rtTA的单一载体系统(Pinducer20.，Pinducer21.)，但这些载体相当大，你可能得到较低的病毒滴度时，使用它们。

关于生物安全，同样重要的是要意识到慢病毒颗粒是一种强大的细胞转导方法——即使是你自己的细胞!因此，在将可能有害的基因插入转移载体时，你应该小心谨慎。例如，表达原癌基因或致癌基因的慢病毒颗粒应小心操纵。看到国家卫生研究院的生物安全准则获取更多信息，并且一定要在开始任何工作之前咨询你所在机构的生物安全委员会。

慢病毒的产生和转导

一旦你克隆到慢病毒转移载体中感兴趣的基因，下一步就是产生病毒颗粒。为此，您将首先需要用转移质粒和包装质粒转染生产细胞，通常是293T细胞。为此，您可以使用您对最舒适的转染试剂。如果您没有任何转染经验，CaCl₂转染是一种简单廉价的技术，应该很好。

转染后很快(4-8h)，细胞开始向培养上清中释放病毒颗粒，一般在转染24h后可获得含有病毒的上清。上清可在4°C或者可以直接添加到目标单元格中。但是在这种情况下你不知道你在培养液中放入了多少病毒颗粒。因为病毒的生产可以从一批变到另一批。为了实验的一致性，净化和滴度你的病毒是个好主意。病毒净化是一个棘手的过程。你必须离心培养上清以沉淀病毒颗粒。一些方案建议在上清液中加入蔗糖，以形成有利于病毒沉淀的密度梯度。对于这个过程，我的建议是测试下面描述的几个协议(协议1，协议2，协议3）找到将为您的系统提供最佳生产的人。

详见我们的协议页面慢病毒生产和转导方案

一旦净化，你必须滴定你的病毒颗粒来确定它们的浓度。三种方法被广泛用于病毒滴定:p24 ELISA给药法检测病毒衣壳抗原p24的表达，FACS给药法将病毒滴度与由GFP编码的病毒转导的细胞数量相关，逆转录酶活性检测采用qPCR定量病毒RNA．所有这些方法已经在前面描述过了188博金宝官网

一旦您了解您的病毒滴度，您可以在不同多种感染的病毒中孵育您的细胞（MOI =病毒与细胞的比率）。同样，我的提示是测试几个协议，因为设置取决于您想要感染的单元格类型。您将发现的大多数协议都将建议使用涤纶（如Colybrene）（协议)或DEAE葡聚糖(协议)，帮助病毒颗粒与目标细胞结合。如果你正在转导非粘附细胞，你可能需要将你的细胞与病毒分离，以帮助病毒结合。这种方法被称为刺法，被发现对治疗非常有效T细胞转导例如。

我希望您能找到此信息对您的实验有用。不要犹豫检查我们的慢病毒载体指南以获得更多的信息，并获得更多的协议和质粒。

参考

1.米勒，A. DUSTY和C. A. R. O. L. Buttimore。重新设计逆转录病毒包装细胞系以避免重组导致辅助病毒生产分子与细胞生物学6.8(1986): 2895 - 2902。PubMed P中期:3785217．公共医学中心PMCID: PMC367857．

2.Naldini, Luigi等。慢病毒载体在体内的基因传递和非分裂细胞的稳定转导科学272.5259(1996): 263。PubMedPMID: 8602510．

3.Yasutsugu Suzuki和Youichi Suzuki（2011年）。基因调控慢病毒载体系统，病毒基因治疗，徐珂博士(编著)，ISBN: 978-953-307-539-6, InTech。

4.沃尔特，W，和斯坦。基188完整比分直播因转移的病毒载体及其在人类疾病治疗中的应用综述毒品60(2000): 249 - 71。PubMedPMID：10983732．

5.基因治疗网慢病毒载体页面188完整比分直播

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