快速，通用的绿色门质粒植物转基因

几年前，研究人员介绍了所谓的金门克隆技术的重大突破。这是第一次，仅仅用两到三种便宜的酶就可以快速有效地组装大量的构建块。现在，一个名为“绿色门”的新工具为在植物模型系统中工作的研究人员提供了所有这些优势。

“克隆都是在体外完成的;在老鼠、人类和植物中都是一样的。Jan罗曼海德堡大学。“不同之处在于你用来将其带入目标生物体的质粒。我们根据先进分子植物科学实验室的日常需求设计了一个金门系统。”

引入GreenGate

正如罗曼和他的同事在《公共科学图书馆•综合》在去年12月介绍该试剂盒的论文中，GreenGate包括植物表达盒中最常用的6个元件:植物启动子、n端标签、感兴趣基因的编码序列、c端标签、植物终止子和转基因植物选择抗性盒。的完成GreenGate工具包该技术还提供了在随后几轮中将多个表达盒堆叠到单个T-DNA上的选项，极大地减少了生成多结构转基因植物所需的时间。

娄曼说，最实际的情况是，与更繁琐、更耗时的传统克隆方法相比，“绿色门”能“帮你节省半年时间”。

金门和绿门的关键组件是IIS类型限制性内切酶。它们与其他内切酶相似，不同之处在于它们在距离识别位点一定距离的任意序列上切割。换句话说，切割和识别是独立的。

“他们看到一个镜头，然后剪切掉另一个，”罗曼说。“这使我们能够设计出具有相同识别位点但酶可切割的不同位点的模块。你只需要一种酶来切割非常不同的碎片。”

由于产生的碎片会有不同的悬挑，它们可以被设计成只在一个管道中以一种方式一起返回。(关于GreenGate工具包及其工作原理的更多细节可参阅在这里.）虽然罗曼说他们只测试过绿色门拟南芥，原则上它应该适用于任何植物物种。

行当

对于那些想在自己的实验室里尝试这种方法的人，罗曼确实有一个特别的建议:小心选择IIS限制型内切酶, BsaI它对温度波动非常敏感。他说，在以99%的效率运转的克隆方法停止工作后，他们的实验室学会了艰难的方法。他们最终将问题追溯到内切酶。

“这只是一种敏感蛋白质，”他说。“除了温柔一点，你别无他法。如果它不再有效，就把它扔掉。”

罗曼和包括约阿希姆·福纳(Joachim Forner)在内的同事们现在期望并希望其他实验室也能忙于“绿色门”项目，在此过程中生产和贡献更多的模块到公共领域。

Lohmann说:“我们有几个动机通过Addgene提供绿色门。“我们坚信，免费分享资料对科学进步是绝对必要的。而且，使用这种系统的人越多，就会有越多的构件可用，使我们的工作更容易。”

参考文献

1.Athanasios lamprooulos等。绿色门-植物转基因的一个新颖、多功能和高效的克隆系统。《公共科学图书馆•综合》．8(12): e83043(2013年12月20日)。

2.Carola Engler等。“一锅，一步，精确的高通量克隆方法。”《公共科学图书馆•综合》．3(11): e3647(2008年11月5日)。