定点突变（SDM）是研究人员用来证明分子生物学和遗传学因果关系的关键工具之一。它可以用来描述启动子或基因中某些区域的功能，以及研究失活/激活突变的影响。在生物医学研究中，使用SDM对患者突变进行建模有助于确定某一变异是否与特定疾病有关。CRISPR使基因组SDM变得相对简单，但基于质粒的SDM却落后了。虽然商用试剂盒可用于制造小的点突变，但大的缺失/插入需要复杂且通常昂贵的步骤体外组装方法。新方法,，重复突变，利用细菌重组工程的力量来创建插入、删除和替换，其效率与吉布森组件和基因艺术克隆-但成本要低得多。继续阅读，了解如何用REPLACR替换SDM方法(R生态联合E线性化的ndsPl阿斯米德A.后P铬).
当前的定点突变方法
当前的SDM方法依赖于体外装配为了进行点突变，你设计了两个具有所需突变的寡核苷酸引物，然后用它们PCR扩增模板质粒。亲代未突变的DNA用甲基化DNA特异酶DpnI消化，然后将非甲基化PCR产物转化为DNA大肠杆菌进行缺口修复。这种方法可以很好地工作，但模板消化不良会导致大量携带未修饰质粒的背景菌落。对于插入，可以使用相同的技术，只使用一种称为megaprimer的大引物。
使用序列同源性将多个PCR产物拼接在一起也很常见。重叠延伸PCR用于根据序列同源性将两个PCR扩增子拼接在一起，随后的产物被消化并连接到适当的载体中。吉布森大会，基因艺术克隆和SLIC都可以用来组装多个片段，但这些方法可能很昂贵，因为它们需要特定的酶，其中一些是专有的。这些方法还依赖于单链DNA末端来匹配同源区域，因此如果片段末端具有二级结构或序列相似性过大，它们将无法工作。
REPLACR突变：让细菌发挥作用
如果您已经使用这些方法中的一些进行了SDM，那么您很可能希望找到更好的方法。Trehan等人。想知道，如果不是依靠体外装配，他们可以使大肠杆菌使用重组工程的原理来完成这项工作。在重组工程中，细菌表达噬菌体重组机制，这有助于通过同源重组进行简单的基因修饰。在大多数重组策略中，只需要3-4个噬菌体蛋白质，这些蛋白质可以通过单独的质粒提供或插入细菌基因组。
REPLACR突变始于熟悉的领域，但很快与之前讨论的方法不同。如上所述，您设计了两个引物，每个引物都包含所需的突变，以扩增质粒模板的两条链。除了包含突变外，引物之间也有一定的同源性~17个碱基是最佳选择。在用DpnI处理以消化掉模板质粒后，这些PCR产物直接从温度敏感质粒转化为表达重组工程蛋白Red/ET的细菌。同源重组然后将线性PCR产物连接到稳定的环状质粒中-无需缺口修复。由于细菌随后在37°C下生长，因此重组工程质粒无法维持。重组效率高到足以消除重组工程中通常需要的选择。
REPLACR突变也非常适合插入和删除。上图显示了底漆设计指南；两种引物中都应有所需的插入物。删除区域时，两个引物应覆盖删除区域周围新连接的末端。REPLACR突变成功地包含了60个核苷酸的插入；除了这个插入尺寸，引物合成比gBlock合成更昂贵，多片段组装方法是首选。此类限制不适用于删除；Trehan等人利用REPLACR突变技术，仅在一次反应中就从细菌人工染色体上删除了高达144 kb的基因。使用其他方法，如“BAC剃须”将需要多个步骤。
REPLACR突变的一个潜在陷阱是，必须对整个质粒进行PCR扩增，这可能会导致突变。使用商用高保真聚合酶，如柯德,卡帕高保真和普西翁，建议用于25kb以下的质粒，大多数克隆体应该是好的，尤其是使用10-12kb范围内的质粒。REPLACR突变还需要制造自己的电兼容细胞，其中噬菌体重组机制是使用L-阿拉伯糖诱导的。这些细胞可以大批量制造和冷冻，适用于许多实验。
当REPLACR突变与Gibson组装和GeneArt克隆进行对头时，结果是有利的。在17 bp同源性的情况下，三种方法的诱变效率（包含突变的菌落/总菌落）分别约为84%。然而，由于您跳过了凝胶纯化和纯化的步骤，因此REPLACR突变更便宜、更快体外重组。在Trehan等人描述的所有修改中，REPLACR突变的中位效率为75%。如果这些数字在各个实验室都成立，那么REPLACR突变可以节省忙碌的科学家很多时间。让我们知道REPLACR突变在您手中是如何工作的！
| 重复突变 | 巨引物PCR | 吉布森组件 | 基因艺术克隆 | |
| 突变类型 | 插入、删除、点突变 | 插入、删除、点突变 | 插入、删除、点突变 | 插入、删除、点突变 |
| PCR反应 | 1. | 1. | 每片段1个 | 每片段1个 |
| 体外装配 | 不 | 不 | 对 | 对 |
| DpnI消化 | 对 | 对 | 不 | 不 |
| 需要纯化的酶 | 不 | 不 | 对 | 对 |
| 需要实验室制造的活性细胞 | 对 | 不 | 不 | 不 |
REPLACR诱变与其他常用定点诱变方法的比较
工具书类
1.Trehan，Ashutosh等人（2016年）。“REPLACR突变：通过重组工程进行定点突变的一步方法。”Sci代表6:19121. PubMed采购经理人指数：26750263. 公共医学中心PMCID:PMC4707547.
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