植物生物学中的RNA干扰：老宠儿的新工具

这篇文章是由客座博主Robert Orr贡献的，他最近收到了Ph、 伍斯特理工学院生物学和生物技术专业。

什么是RNAi？

功能丧失(LOF)实验是我们理解复杂生物过程的基石。在DNA、RNA或蛋白质水平上，有许多工具可以直接或公正地扰乱生物功能。工具的“正确”选择需要在生物学问题的范围内仔细权衡任何技术的固有优点和局限性。例如，虽然基因敲除长期以来被认为是LOF研究的“金标准”，但在植物中发现的高基因拷贝数使传统的敲除从实用的角度没有吸引力。因此，作用于DNA下游的技术，如RNA干扰，可以不依赖基因拷贝数而可逆地发挥其作用。

RNA干扰(RNAi)是一种保守的真核生物过程，大约20-30个核苷酸的双链RNA (dsRNA)会导致任何包含与dsRNA序列互补的基因的下调或“沉默”(Wilson and Doudna, 2013)。

RNAi包括两条非独占性基因沉默途径：转录和转录后基因沉默（PTGS）。在这两种途径中，短双链RNA片段（siRNA）都是由长双链RNA通过名为Dicer的RNase III酶产生的（图1）。植物王国已经扩大了Dicer酶的种类，这些不同的Dicer样酶参与了不同小RNA的生物发生（图1）。这些siRNA可以通过靶向mRNA降解、阻断翻译或互补基因序列的染色质修饰发挥其基因沉默作用（图1）。因此，外源性应用长或短双链RNA很容易诱导基因沉默。然而，值得注意的是，裸的和未修饰的dsRNA会引起免疫原性反应，从而使RNA干扰的有效性和解释复杂化。幸运的是，研究缺乏这种先天免疫的植物和其他生物的研究人员不必担心，并且受益于dsRNA应用的易用性。

图1:rnai诱导转基因的示意图。通常，RNAi所需的靶标是由一个环区分开的反向重复序列表达的，这有助于形成发夹式RNA结构，从而导致内源性RNAi机制的加工。或者，内源性miRNA前体可以被设计成人工miRNA。经过处理的miRNA或sirna然后转录或转录后沉默靶基因。在植物中，不同的dicer-like酶(DCL)将双链rna加工成特定类型的干扰rna。

RNAi与CRISPR：互补技术

公平地说，CRISPR已经彻底改变了分子生物学，并以前所未有的方式实现了功能研究。随着CRISPR技术的迅速崛起和多样化，人们可能会错误地将RNAi归入历史。RNAi的直截了当是无与伦比的，不像CRISPR实验需要外源蛋白，成功诱导RNAi只需要dsRNA的存在。在植物中，CRISPR技术主要用于破坏DNA水平上的功能，从而限制了CRISPR在高拷贝数和低可及性基因组位点上的有效性。此外，基因敲除策略不能用于研究必需基因。

从历史上看，基因沉默方法被认为受到普遍的脱靶效应的影响。这一结论基于同一基因的基因沉默和基因敲除方法之间的许多表型差异。然而，最近的研究对这一普遍的假设提出了质疑。具体而言，由于使用外显子跳跃、替代起始密码子和/或转录适应现象，被认为是敲除的CRISPR产生的突变体可以维持部分功能（Smits等人，2019年；Sztal和Stainier，2020年）。此外，一项在高通量生存筛查的背景下直接比较CRISPR和RNAi的研究发现，这两种技术都相当精确，但每种方法都恢复了已知的生存能力所需的不同基因（Morgens et al.，2016）。只有将这两种方法产生的数据结合起来，才能形成一个更全面的基因列表，准确地反映已知对细胞生长至关重要的基因范围。总之，这项出色的工作强调了使用正交方法自信地总结感兴趣基因功能的重要性。

RNAi工具

可以说，RNAi的最大优势在于该技术的直截了当性，即与您的一个或多个感兴趣的基因互补的dsRNA能够触发RNAi激活。

典型的RNAi实验可分为三个基本步骤：

• RNAi触发器的创建
• 传递RNAi触发器
• 描述了RNAi表型。

尽管所有这些步骤都是积极发展的领域，但第一步必然决定了随后两个步骤的方向和范围。因此，我将重点介绍基于RNAi研究的第一阶段中存在的不同方法和考虑因素。

RNAi触发器的创建需要一些初始考虑，如起始物质(基于dna的载体或纯化RNA)和激活RNAi机制(长链双链RNA，典型的发夹RNA，或人工microRNA)时的双链RNA的初始状态。使用DNA模板进行RNA干扰触发是最普遍的方法，因为它易于使用，并且能够产生长期的RNA干扰表型。

长发夹RNA

诱导RNA干扰的最简单方法是长发夹RNA（hpRNA）的表达。这种方法是由DNA结构促进的，它可以插入约400个碱基，作为反向重复，与你的基因目标互补（图1）。有了这项技术，如果一个基因使用一致序列（目标之间约90%的一致性）或串联多个目标序列. hpRNA已广泛用于植物研究，许多不同的结构可供社区使用。每种结构都有独特的特征，如hpRNA的诱导表达和/或将基因目标序列融合到荧光报告序列（下文讨论）。这些构造的示例包括pGAPi，通过基于网关的克隆和进行RNAi的植物的直接正面选择，可以轻松创建长hpRNA，以及LIIbeta F 1-2 RNA干扰，它允许通过金门克隆组装内含子拼接的HPRNA。

人工微RNA和短发夹RNA

长hpRNA方法的最大局限性被认为是脱靶效应和可变的沉默效率。为了解决这些缺点，短hpRNAs (shrna)和人工微rna (amiRNAs)都被经常使用。尽管类似，amirna是由基因组中发现的内源性microrna前体改造而成，而shrna是外源性的。重要的是，使用shRNA/amiRNA只产生一个~21 nt干扰RNA，而不是由长hpRNA触发产生的各种sirna。尽管sh-和AMIRNA可能比长hpRNAs更具特异性，但必须对其进行单独工程并对其基因沉默功效进行经验评估，因此需要大量的时间投资。

一旦靶mRNA被切割，被切割的mRNA可以诱导进一步一轮RNAi。这个过程被称为“传递性”，对任何关于给定RNAi技术的特异性的说法都提出了质疑。传递性增强了RNAi的效力，同时也增加了脱靶效应的发生。然而，基于amiRNA的RNAi实验通常表现出高度特异性和健壮的基因沉默(在amiRNA初始优化后)。虽然下游工作是必需的，但可以在Addgene找到几个载体，可以作为一个良好的开端(#22988，#137884)。这两种载体都允许分别以水稻和拟南芥的miRNA前体为基础创建amirna。

短发夹状RNA（shRNA）在概念上类似于上述microRNA前体，是哺乳动物研究界一种流行的RNA干扰触发因子。幸运的是，哺乳动物shRNA的许多工具可在Addgene获得。

识别主动沉默植物

一旦你将RNAi引入你的生物体，你如何识别主动沉默的RNA？在这里，我将介绍一些筛选方法来识别它们。

视觉筛选

不管你决定的是哪种RNAi触发类型，任何RNAi实验都得益于一种识别和量化主动沉默植物的简单方法。非破坏性方法，最常用的是荧光报告，直接将基因靶点的沉默与报告基因的沉默结合起来．这是在DNA构建的水平上实现的，rnai靶点在反向重复方向上融合到包含针对荧光报告基因的目标序列的DNA主链上。因此，一个发夹式dsRNA被产生，它包含了针对你感兴趣的基因和报告基因的序列。这种方法大大提高了实验吞吐量，因为沉默的植物可以很容易地识别和易于观察的表型量化。基于荧光报告的RNAi结构已经被设计并广泛应用于植物中，例如开花植物模型拟南芥（Li等人，2013；Zhang等人，2018）和模式苔藓植物石首鱼（小孢子藻）专利（Bezanilla等人，2005年；Nakaoka等人，2012年）。

一种新的基于正选择的RNAi方法

到目前为止，所有基于DNA的RNA干扰实验通常都涉及抗生素选择，以检测RNA干扰转基因的存在，然后是RNA干扰活性的荧光读数。作为一名植物研究人员，传统的hpRNA和目视筛选方法在两个方面受到限制：可变沉默效率和分离RNAi植物的劳动密集型过程。有了RNAi的可视化报告器，表型，如形态学参数，可以很容易地进行评分。然而，确定特定目标的转录本或蛋白质丰度需要对视觉识别的亚群进行物理分离。对于传统的细胞培养，通过荧光激活细胞分选（FACS）可以很容易地富集活性RNAi亚群。在有限的单细胞原生质体分析之外的植物中，这是不可能的。取而代之的是，显微镜下的植物必须通过荧光报告器目视识别为正在进行RNAi并手动提取。这一过程既繁琐又耗时，因为生长表型降低的RNAi突变体需要额外的植物来拥有足够的组织来进行下游表征。

同时解决传统RNAi方法的两个局限性Luis Vidali实验室设计了一种新的RNAi方法。我们没有使用荧光输出来监测RNAi，而是设计了一个阳性选择报告器，通过该报告器，存活本身就表明活跃的基因沉默。我们通过创建直接将任何基因靶向序列与腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APT）基因的靶向序列融合的结构来实现这一点，该基因在许多生物体中都是保守的。当补充2-氟腺嘌呤（2-FA）等腺嘌呤类似物时，具有功能性APT的生物体将2-FA转化为细胞毒性核苷酸，导致死亡。在2-FA存在的情况下，APT的有效基因沉默是生存所必需的。通过将APT的沉默与任何感兴趣的基因靶点结合起来，只有主动沉默到足够程度的生物体才能存活。这可能会降低RNAi输出的可变性，并使下游特征化，因为可以收获整个培养物而不是显微镜下分离。进行基于APT的RNAi实验所需的质粒为现在可以在Addgene上使用. 这些包括允许容易插入任何靶序列的结构，以及基本的控制质粒。

非常感谢我们的客座博主罗伯特·奥尔！

罗伯特·奥尔最近获得了博士学位。在伍斯特理工学院的生物学和生物技术专业，他在路易斯·维达利实验室研究了植物是如何实现细胞极化生长的。在他的下一次冒险中，他将加入苏黎世大学达伦·吉尔摩的实验室。他着迷于生物体如何在细胞和多细胞尺度上精细而有力地自我组织。

工具书类

Bezanilla M，Perroud P‐F.，Pan A，Klueh P，Quatrano RS（2005）一种在Physocmitrella patens中具有沉默内部标记的RNAi系统允许快速识别功能丧失表型。植物生物学7:251–257。https://doi.org/10.1055/s-2005-837597

李杰福，钟HS，牛Y，布什J，麦科马克M，辛J（2013）植物中有效基因沉默的基于蛋白质的人工微RNA综合筛选。植物细胞25:1507–1522。https://doi.org/10.1105/tpc.113.112235

Morgens DW，Deans RM，Li A，Bassik MC（2016）CRISPR/Cas9和RNAi筛选关键基因的系统比较。Nat Biotechnol 34:634–636。https://doi.org/10.1038/nbt.3567

Nakaoka Y, Miki T, Fujioka R, Uehara R, Tomioka A, Obuse C, Kubo M, Hiwatashi Y, Goshima G(2012)一种可诱导的RNA干扰系统揭示了Augmin在Phragmoplast微管生成中的主导作用。植物学报24:1478-1493。https://doi.org/10.1105/tpc.112.098509

斯密茨·阿赫、齐贝尔·F、乔伯蒂·G、津恩·N、米勒·WF、克劳德·明斯特S、埃伯哈德·D、Fälth Savitski M、格兰迪·P、雅各布·P、米洪·A-M、孙·H、泰斯默·K、布鲁克斯特·T、班切夫·M、施泰因梅茨·LM、德雷维斯·G、休伯·W（2019）生物可塑性拯救CRISPR敲除中的目标活动。Nat方法16:1087–1093。https://doi.org/10.1038/s41592-019-0614-5

Sztal TE，Stainier DYR（2020）转录适应：遗传稳健性的基础机制。开发147:dev186452。https://doi.org/10.1242/dev.186452

(2) RNA干扰的分子机制。生物物理学年鉴42:217-239。https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-083012-130404

张楠，张丁，陈素丽，龚伯Q，郭烨，徐磊，张晓楠，李建福（2018）工程化人工微RNA用于多重基因沉默和简化转基因筛选。植物生理学178:989–1001。https://doi.org/10.1104/pp.18.00828

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