Rosella:研究自噬的荧光ph -生物传感器

罗塞拉是一个pH-sensitive荧光生物传感器最近在Addgene中沉积的马克·普雷斯科特博士．本系统用于监测和分析酵母细胞的细胞质和细胞器的自噬。自噬(希腊语，意为“自我吞噬”)是由营养缺乏引起的，以细胞质和细胞器为目标，进入液泡/溶酶体进行降解和循环。Rosella的自噬感知能力的关键在于，当它从一个更中性的pH室，如细胞质，到液泡的更高的pH时，它的荧光发射光谱发生了变化。继续读下去，了解更多关于研究自噬的先前方法，以及Rosella如何改进它们。

研究自噬的方法

生化检测

• 长寿蛋白降解：这种方法测量放射性标记的长寿蛋白作为自噬替代物的降解率。细胞与同位素标记的氨基酸一起培养数小时至数天，然后用未标记的氨基酸进行短期生长。这个洗出期主要通过蛋白酶体降解去除放射性标记的短命蛋白质。然后通过测量培养上清液中的放射性量来诱导和量化自噬（这表明蛋白质降解）。为了控制其他途径引起的蛋白质降解，标准做法是比较使用或不使用自噬抑制剂处理的样品之间的降解率。虽然这种方法确实提供了自噬的定量测量，但它只测量大量自噬（而不是提供关于正在降解的蛋白质或细胞器的更细粒度细节），而且速度较慢。

• 碱性磷酸酶活性:在酵母中PHO8基因编码液泡碱性磷酸酶。正常情况下PHO8在内质网合成，通过分泌途径传递到液泡，然后裂解生成活性形式的蛋白质。为了监测自噬，我们表达了Pho8Δ60突变蛋白。Pho8Δ60以非活性形式定位于胞质，除非诱导自噬。然后胞质的非选择性大自噬导致Pho8Δ60在液泡中积累，在液泡中它被裂解生成一种活性酶。Pho8磷酸酶活性或Pho8从未裂解到裂解的分子量转移是本实验的最终读数。这也是自噬的定量测量，但是，就像上面的蛋白质降解分析一样，它是缓慢的，而且只测量整体自噬。

形态分析

• 电子显微镜电子显微镜是研究自噬的传统方法。这种方法依赖于基于形态学识别自噬结构。自噬体相对容易识别:双膜结构包含未消化的细胞质内容物。与液泡或溶酶体融合的自噬体更难识别，因为它们的内容物可能处于不同的降解阶段。此外，电子显微镜分析是费时的。

• gfp标记的Atg8p或LC3：ATG8是影响自噬的一组基因(ATG在酵母)。Atg8p(“p”代表蛋白质)与自噬体膜有关，因此用GFP标记它可以跟踪酵母中自噬体前结构、自噬体和自噬体的定位或积累。哺乳动物Atg8p同源物，即gfp标记的LC3，也可以用来监测自噬，但在某些条件下，它以自噬无关的方式聚集。此外，跟踪Atg8p或LC3不能提供关于自噬体内容的信息，也不能提供关于液泡或溶酶体中被降解的信息，因为一旦自噬体与液泡或溶酶体融合，Atg8p和LC3都会被降解或释放。

罗塞拉荧光性质

Rosella是一种双色发射生物传感器，以一种色彩鲜艳的澳大利亚鹦鹉命名。它由两个串联荧光蛋白组成:相对ph不敏感的RFP变体，Ds金宝搏app下载Red。T3和ph敏感的GFP变异，超黄道荧光蛋白(SEP)。它们由一个9个氨基酸连接在DsRed.T3的c端。Rosella的激发和发射光谱总结见表1。DsRed是Rosella的永久荧光标记部分:无论在细胞中的位置如何，它都会发出红色荧光。SEP的pH敏感性意味着Rosella会发出绿色荧光，除非它是在酸性环境中，如液泡或溶酶体。根据Rosella的定位，我们总结了它发出的荧光颜色，详见表2。

表1:罗塞拉的激发和发射光谱综述。

* Rosado等人确定的最优顺序激发波长:参见表2了解pH对Rosella荧光特性的更多细节。

表2:定位对Rosella荧光发射的影响。

用Rosella研究酵母的自噬

当没有信号序列表达时，Rosella靶向胞质，并通过柠檬酸合酶的线粒体靶向序列靶向线粒体。在正常生长条件下，两种变体都被排除在液泡之外，并发出红色和绿色荧光。氮饥饿诱导自噬4小时后，液泡内积累红色而非绿色荧光。图2是细胞质线粒体Rosella有和没有自噬时荧光的一个例子。在这两种情况下，液泡中的红色荧光随着暴露于自噬诱导条件的时间延长而增加。

Rosella使研究自噬背后的机制更容易，通过跟踪什么被运输到酵母液泡(如细胞质，线粒体)，而不是跟踪一般的自噬标记。这对于比较整体自噬和线粒体的靶向自噬特别有用。所示萨尔基扬等。也可以使Rosella融合，从而监测你感兴趣的蛋白质的自噬。

你准备好试试罗塞拉了吗？两者cytosol-targeted和mitochondria-targeted变体可从Addgene获得。

工具书类

1.罗萨多，米jaljica, D, Hatzinisiriou, I.， Prescott, M.， & Devenish, R. J.(2008)。一种荧光ph生物传感器，用于报告酵母胞质和细胞器的液泡翻转。自噬,4(2), 205 - 213。doi: 10.4161 / auto.5331。PubMedPMID: 18094608

2.范迪诺，L. B.， Labasky, M. E.， Forostyan, T.， colsimo, L. K.， Graham, T. E.(2015)。使用单一荧光生物传感器快速平行测量哺乳动物细胞的巨噬和自噬。科学报告,5(1) doi: 10.1038 / srep12397。PubMedPMID: 26215030．公共医学中心PMCID: PMC4517063．

3.Mizushima, N.， Yoshimori, T.， & Levine, B.(2010)。哺乳动物自噬研究的方法。细胞,140(3), 313 - 326。doi: 10.1016 / j.cell.2010.01.028。PubMedPMID: 20144757．公共医学中心PMCID: PMC2852113．

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Addgene博客上的额外资源188博金宝官网

• 当心荧光蛋白低聚
• 看到红色:简单的GFP光电转换
• 薄层荧光显微术

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