本文由萨拉维蒂斯科什来自爱荷华州立大学。
自出现以来，SARS-CoV-2已扩散到世界各地，并已成为一场全面的大流行。遏制这一病毒的传播已成为世界各国的当务之急，为了做到这一点，世卫组织建议采取一种策略:检测、跟踪和保持社交距离。
随着像韩国这样的国家——疫情早期的中心之一——最终使曲线变平，很明显，广泛的检测对于控制这场大流行至关重要。目前，CDC使用RT-qPCR检测来诊断COVID-19，并使用一些血清学检测来确定过去的接触情况。然而，试剂和设备的可用性有限，周转时间长，导致研究人员转向其他技术，如CRISPR。
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| 图1:基于CRISPR/Cas的COVID-19检测方法总体示意图 |
基于CRISPR的detect assay快速检测2019新型冠状病毒SARS-CoV-2
灵敏度：每微升10-100份RNA副本
时间: ~ 40分钟
所需设备：37°C热阻和62°C热阻
方法:提取病毒RNA，以SARS-CoV-2的E基因和N2基因为靶点，进行等温扩增。如果Cas12a- sgrna复合物与目标序列结合，Cas12a活性被激活。这释放了任意的ssDNA裂解活性，裂解了提供的荧光标记的ssDNA底物。在裂解时，荧光不再淬灭，可以用横向流动条目测到。由于探针是用链霉亲和素标记的，横向流动条带首先通过生物素捕获探针的链霉亲和素部分。被切断的探针荧光部分将继续流动，并被条带上进一步的抗体捕获。
突出了：在测试的83个已知的Covid阳性样品中，阳性预测率为95％和100％的负预测率。它也是到目前为止开发的最快测试。类似的方法已经过优化直接使用唾液检测SARS-COV-2病毒不需要进行RNA提取，但只有在有足够高(105每微升副本）唾液中的病毒载量（Lucia等，2020）。
基于crispr的SHERLOCK (Specific High - sensitivity Enzymatic Reporter unlock)技术检测冠状病毒
灵敏度：可以检测到每毫升的单分子 - 在ZeptOmolar范围内
时间: ~ 1小时
设备要求: 37℃水浴和42℃水浴
方法:从样本中提取RNA，使用市售的扩增试剂盒进行等温重组酶聚合酶扩增(RPA)。在这种情况下，基因S和Orf1ab的区域被扩增。RPA反应也含有逆转录酶产生cDNA。等温放大是在一个恒定温度下进行的，不需要热循环器。接下来是体外转录，然后用Cas13来检测感兴趣的扩增区域。Cas13使用互补的crRNA序列与样品结合，并在结合后被激活。这种激活导致反式裂解反应，裂解附近含有荧光团的RNA序列，该荧光团在完整时熄灭，在裂解时释放。劈裂会产生荧光，这种方法可以纳入侧向流读出滑块，从而实现快速检测。
突出了：Cas13a在CRNA中的两个或更多个错配的存在下不催化活性：靶双链体，并且不会对高度相似的病毒产生阳性结果。与CAS12A不同，CAS13A不需要在目标站点上进行严格的序列偏好，而CAS12A则需要PAM（Protospacer相邻的主题)目标乳沟。对于具有挑战性的样本，该测试可以在两步中执行，如two - step - sherlock，或以快速、高吞吐量的方式在一步中执行，如one - pot - sherlock。两步sherlock的灵敏度在zeptomolar范围，而一步sherlock的灵敏度在femto-aptomolar范围。有关这些方法之间差异的更多细节，请查看这表．
All-in-one dual CRISPR/Cas12a (aid -CRISPR) assay -用于快速、超灵敏和视觉检测新型冠状病毒SARS-CoV-2
灵敏度: 40分钟孵育4.6-11拷贝/微升RNA靶标
时间：〜90分钟
需要设备：37°C热块，LED蓝光发光器或UV光照明器。
方法：与Sherlock诊断测试高度相似，该测试在步骤顺序和使用CAS蛋白的使用序列中变化。这里，将反应所需的所有组分在单一的一锅反应系统中混合并在一次温度下孵育。设计了两种CAS12A-CRRNA复合物，每个CAS12A-CRRNA复合物，每个结合到靠近底漆识别位点的反向转录的靶序列的一股并分开加入。使用与两个区域结合的两个CRRNA提高了测定的灵敏度。该反应还含有SSB，链位移DNA聚合酶，重组酶和在切割时表现出荧光的SSDNA-FQ记者。在通过RPA引物扩增时，CAS12A-CRRNA与靶序列中的互补区域结合，并且该活性导致SSDNA-FQ报道的跨裂解导致荧光。CAS12A结合所有扩增的靶区域并导致SSDNA-FQ记者的连续切割。可以在没有激发光，UV光或LED蓝光下观察所得到的荧光。
突出了：这是一锅，一次性反应，几乎单分子敏感。在HIV-1和SARS-COV-2检测的情况下，无前置放大的AIOD-CRISPR能够检测到1.2拷贝DNA靶标和4.6拷贝的RNA靶标在40分钟内孵育。
基于cas13检测SARS-CoV-2遗传物质的可扩展、易于部署的协议(CREST)
灵敏度：每微升的10个RNA拷贝
时间：本文未提及，可能大约1-2小时
需要设备: DIY-Bio微型PCR仪，P51纸板荧光仪，9V电池
方法：此预印刷品使用先前开发的方法检测样品中的SARS-COV-2。首先，提取RNA并受逆转录。然后使用Taq聚合酶通过PCR扩增该，然后转录以提供Cas13的RNA基材。CAS13在发现GRNA和给定的荧光标记的衬底之间的互补后，被激活并进行非特异性的抵押裂解。该裂解与荧光可视化偶联。然而，在该技术中，代替使用横向流动条检测荧光标记的RNA的切割，代理商使用P51纸板荧光可视化器，该P51纸板荧光可视化器由使用蓝色LED和橙色过滤器使用的9V电池供电，以检测在切割时检测荧光．
突出了：通过PCR而不是RPA扩增逆转录的RNA样品。与RPA不同，该技术使用Taq聚合酶，其广泛可用，更便宜。作者而不是使用典型的PCR机器，而不是使用实惠的现场就绪，使能够是电池的蓝牙的PCR机器，可以通过DIY-BIO运动来获得。
使用FnCas9 (FELUDA)进行快速、现场可部署的碱基检测和鉴定
灵敏度: - 110 femtomolar
时间:没有提到，可能是1-2小时
需要设备：PCR机/热块，侧面流动条，琼脂糖凝胶设备，荧光发射读卡器
方法FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay (FELUDA)是一种使用FnCas9的技术，FnCas9是一种对DNA内不匹配的存在和这些不匹配的位置高度敏感的蛋白。采用生物素化引物PCR/RPA扩增SARS-CoV-2核酸。然后用链霉亲和素包被珠固定。荧光标记的dCas9复合物包含sgRNA，与固定的目标序列没有错配。结合后，荧光的变化可以显现出来。另一种方法是将同样的概念应用于含有链霉亲和素的横向流动条带，链霉亲和素可以与生物素化的目标结合。他们还试图确认琼脂糖凝胶上的目标结合，在合适的结合上的裂解反应会产生两个条带，而不是在没有裂解的情况下产生单个条带。
突出了:为了检测非PAM区域，可以将PAM工程到引物中。这种方法不依赖于酶的侧切，而是依赖于其对目标区域的活性，从而使其成为一种基于亲和的方法。由于FnCas9的错配敏感性，这也是诊断单核苷酸变异的好方法。此外，FnCas9在10-50°C之间的温度范围变化。
非常感谢来自爱荷华州立大学的嘉宾博主Shravanti Surest。
Shravanti Suresh是爱荷华州立大学Sashital实验室研究CRISPR/Cas免疫系统的细胞方面的博士候选人。她对科学传播和使发展中国家能够获得科学非常感兴趣。你可以关注她的推特@shra_krishna。
参考
Azhar, M.， Phutela, R.， Ansari, A. H.， Sinha, D.， Sharma, N.， Kumar, M.，…Maiti, S.(2020)。使用FnCas9进行快速、现场可部署的碱基检测和识别。https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167
Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Servellita V, Singh J, Miao X, Streithorst JA, Granados A, Sotomayor-Gonzalez A, Zorn K, Gopez A, Hsu E, Gu W, Miller S, Pan C-Y, Guevara H, Wadford DA, Chen JS, Chiu CY(2020)基于crispr - cas12的SARS-CoV-2检测。自然生物技术。https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4
Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F (2019) SHERLOCK: CRISPR核酸酶的核酸检测。自然协议14:2986-3012。https://doi.org/10.1038/s41596-019-0210-2
Lucia，C.，Federico，P.-B.，＆Alejandra，G.C。（2020）。基于CRISPR-CAS12的超敏感，快速，便携式冠状病毒SARS-COV-2序列检测方法。冷泉港实验室。https://doi.org/10.1101/2020.02.29.971127
Rauch, J. N.， Valois, E.， Solley, S. C.， Braig, F.， Lach, R. S.， Baxter, N. J.， Kosik, K. S.， Arias, C.， Acosta-Alvear, D.， & Wilson, M. Z.(2020)。一种可扩展、易于部署的基于cas13的SARS-CoV-2遗传物质检测方案冷泉港实验室。https://doi.org/10.1101/2020.04.20.052159
基于CRISPR技术的新型冠状病毒感染症(COVID-19)检测方法研究https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/covid-19%20detection%20（updated).pdf.
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