通过短暂的植物叶子转换节省时间

本文由东北大学博士研究生塞缪尔·莫滕森撰写。

与植物打交道并不总是一个耗时的过程。在组织培养中培育转基因毛状根需要半年的时间，而培育转基因植物则需要更长的时间，植物叶片的短暂转化过程可以为植物生物学家节省一些时间，实际上是几个月。

在Lee-Parsons实验室，我们正在研究癌症治疗药物长春碱和长春新碱的生产是如何在药用植物中进行调控的Catharanthus roseus也叫(图1)我们研究的最终目标是提高它们在植物或植物组织培养中的产量。

c . roseus也叫模范生物不是像拟南芥或烟草。基因功能研究c . roseus也叫受到方法可用性的严重限制。感染农杆菌属rhizogenes可用于组织培养中形成稳定的毛状根系。这种方法常用在c . roseus也叫，但是在毛状根中无法研究光合活性组织的特定过程，因为根中缺少功能性的叶绿体和特殊的叶细胞类型。转基因毛状根的发育至少需要6个月。培育转基因植物需要更长的时间，需要更多的劳动，效率低下，而且往往无法繁殖。在创建转基因培养或植物之前，我们的瞬时表达方法使我们能够快速筛选和研究转录因子候选和生物合成途径中的基因调控。

为什么植物科学家要做短暂的叶子转变

转基因植物的发展是非模式生物中普遍存在的问题。因此，瞬时方法通常是研究基因功能的首选，因为这些实验可以在几天到几周内完成，而不是几个月到几年。在植物科学中，“瞬时转化”通常是指从转化的组织中既不能再生出稳定的细胞系，也不能再生出植物。基因功能的研究通常是通过瞬时沉默和/或过表达植物感兴趣的基因。

一种沉默基因的常用方法

病毒诱导基因沉默(VIGS)是一种利用病毒和植物的转录后机制来沉默感兴趣的基因的瞬时技术(Unver和Budak, 2009)。这种方法很适用于c . roseus也叫．

过度表达基因的一种常见方法

在植物拟南芥和烟草,农杆菌属叶片渗透是基因过表达和功能评价的一种简单而有效的方法。在自然界中农杆菌属含有带有T-DNA(转移dna)区域的质粒。在感染过程中，T-DNA区域转移到植物中。在实验室中，我们可以利用这个自然过程，用我们感兴趣的基因或报告基因替换T-DNA区域的基因，这样就可以跟踪转化和基因表达。在一个短暂的叶子转变过程中，工程农杆菌属菌株与叶片组织接触，带有相关基因的T-DNA区域被转移到细胞中。但对于C．roseus也叫，农杆菌属渗入树叶的效果并不好，因为叶子有蜡质的质地，很难渗透。

我们最近在c . roseus也叫通过与幼苗一起工作，并优化瞬态转化过程的其他几个方面(Mortensen等人，2019)。该方法也可为其他物种的瞬态转化体系的发展提供一些有益的指导。

用。开发瞬态叶变换方法时需要考虑的问题农杆菌属：

如果您是该领域的新手，以下是对您的第一次瞬态叶子转换有用的提示:

检查你的物种是否有可用的工作协议

这将节省你很多时间。不要重复发明轮子。

测试不同叶龄

通常年轻的员工工作得更好。并不是每一片叶子都同样容易受到瞬时变化的影响。

选择好的报告基因

有许多伟大的报告基因你选择哪一个取决于你的实验(de Ruijter et al.， 2003)。例如，我们对GUS基因进行了初步转化，看看转化是否成功。一旦我们走上了正确的轨道，我们就转向了荧光素酶，以便更容易量化不同处理对转化成功的影响。下面是一些报告基因的例子。

• GUS基因(β-葡萄糖醛酸酶)的组织化学GUS染色是一个非常有用的可视化报告(图2)。GUS酶裂解底物，然后形成蓝色沉淀。GUS通常是建立新的转化方案的首选，因为它可以很容易地显示哪些组织已经转化。但要注意:检查你的组织中类似于gus的活动。用…运行控制农杆菌属缺乏GUS基因，因为植物可以有内源性GUS-like活动(Hu et al.， 1990)。我们通常使用pSB161 - pL2_pSB90_2x35S::格斯::载确认改造成功。
• 荧光素酶是伟大的定量报告和使用底物产生生物发光。荧光素酶通常比GUS有更短的mRNA和蛋白质半衰期，因此是测量启动子活性的良好时间报告。有益的积极控制可包括:pSB96 - pL2_pSB90_2x35S:: fLUC-I:: tno＆pSB166 - pL2_pSB90_tMAS:: rLUC-I:: pma．
• 金宝搏app下载荧光蛋白(FP，例如GFP)有许多用途。通常一个FP被融合到一个感兴趣的蛋白质来阐明你感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。

找到李-帕森斯实验室的所有质粒。

测试不同的叶片渗透方法

• Co-cultivation(Li et al.， 2009):共培养农杆菌属用你的叶子是一种非常简单的转化方法，但在许多物种中是低效的。更有效的方法是注射器或真空渗透。
• 注射器渗透(D’aoust et al.， 2009):通常没有针头的注射器用于注射农杆菌属通过气孔培养到叶片的背面(下表面)。这是一个简单且易于实现的技术。成功可能会因实验者而异。
• 真空渗透(Mortensen et al.， 2019):叶子或整株植物被放置在农杆菌属溶液和真空是用真空钟形或干燥器施加的。成功的浸润通常可以通过组织下沉看到(见图3)。这种方法可能是最可扩展的方法。

把你的植物转移到黑暗中变身前16小时．

我们通常在转化前16个小时将植物转移到黑暗中，然后在转化后让它们在黑暗中多待两天。

使用内含子

植物启动子可以被识别或漏入农杆菌属．这在报告基因中尤其成问题，因为你可能会观察到农杆菌属，但不包括植物。例如，我们已经看到强烈的表达格斯CaMV 35S启动子的基因农杆菌属．这可以很容易地通过使用内含子来避免，内含子可以从植物的转录本中移除，但不会从植物的转录本中移除农杆菌属．

测试不同的农杆菌属菌株

我们使用了解除武装的武器根癌土壤杆菌菌株GV3101(pMP90)，对我们很有效。

使用有效的矢量系统

这允许您快速组装向量并测试不同的想法。我们是他的超级粉丝基于金门的MoClo系统．上面这篇博文中提到的向量已经可以使用向量了，但是使用MoClo系统，您可以轻松快速地创建定制的向量。想了解更多关于MoClo植物的信息，请点击这里采访尼古拉·Patron，分享了MoClo植物试剂盒通过Addgene．

对我们来说，瞬时叶转化在筛选候选基因和加速研究方面有很大的帮助。当然，还有更多关于瞬时叶转换的内容，但是我们希望这些提示能够帮助您入门。一旦你在你的实验室建立了一个良好的工作协议，它将成为你研究的一个强有力的工具。请在下面的评论中添加更多的技巧和经验。

非常感谢来自东北大学的客座博主塞缪尔·莫滕森。

塞缪尔·莫特森她是马萨诸塞州波士顿东北大学的博士生。他在莱布尼茨Universität汉诺威(德国)获得了植物生物技术理学学士和理学硕士学位Lee-Parsons实验室．

参考文献

D'Aoust, Marc-André等。"利用注射器农业渗透在植物中瞬时表达抗体"来自植物的重组蛋白．胡玛纳出版社,2009年。每周。PubMedPMID: 19183892．

De Ruijter, n.c.，等。“GUS, LUC和GFP报告系统在植物基因表达研究中的评价和比较。”植物生物学5.02(2003): 103 - 115。

胡静叶，等。“种子植物中固有的类gus活性。”植物细胞的报道9.1(1990): 1 - 5。PubMedPMID: 24226366．

李敏宇，杨宜农。"农业渗透叶片的瞬时表达试验"拟南芥的协议．胡玛纳出版社,2006年。225 - 229。PubMedPMID: 16739580．

李建峰，等。“FAST技术:一种简化的基于农杆菌的转化方法，用于拟南芥和其他植物幼苗的瞬时基因表达分析。”工厂方法5.1(2009): 6。PubMedPMID: 19457242．公共医学中心PMCID: PMC2693113．

莫滕森，塞缪尔等。“EASI转化:一种分析Catharanthus roseus幼苗基因功能的高效瞬时表达方法”植物科学前沿10(2019)。PubMedPMID: 31263474．公共医学中心PMCID: PMC6585625．

Unver, Turgay和Hikmet Budak。病毒诱导基因沉默，一种转录后基因沉默方法国际植物基因组学杂志2009(2009)。PubMedPMID: 19547658．公共医学中心PMCID: PMC2699436．

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