利用数字PCR技术筛选成功的基因组编辑

这篇文章是由艾伯塔大学博士后研究员S·法伊得提供的。

如果你和现在的许多研究人员一样，你已经准备好（如果你还没有准备好的话）投身于精确的世界基因组编辑。当需要（希望如此）验证您最喜欢的基因的成功突变时，有几种不同的方法可供使用。谢天谢地，有许多优秀的资源可帮助您在突变验证的艰难过程中获得指导，例如“CRISPR 101”邮政编码．下一代测序技术是黄金标准，但对许多实验室来说，它们仍然成本高昂，对于小型项目来说往往不切实际。大多数研究人员转而采用所谓的“错配核酸酶”测定法(例如:Surveyor^®或T7E1)进行突变检测。虽然这些方法为突变验证铺平了道路，但我们发现这些分析工作令人沮丧，耗时，并提供的信息很少。在这篇博文中，我们将介绍数字PCR作为一种新兴的验证技术。与失配核酸酶分析相比，数字PCR有几个优点，下文将详细阐述。

数字PCR

数字PCR（dPCR）涉及将样本分成数千个物理隔离的分区（如芯片上的液滴或孔），这样大多数分区将包含一个或不包含目标DNA的副本。然后进行常规热循环，使用聚合酶链反应．而不是跟踪和实时PCR反应的进展,每个反应分区是单独评估的积极或消极的(数字)信号的反应(图1)。分区,不包含任何目标DNA PCR的发病是消极的,而那些是积极的。由于有成千上万的分区，统计模型可以用来确定存在于原始样本中的目标DNA分子的实际数量，具有很高的精度。这意味着数字PCR提供了目标丰度的绝对测量，不需要标准曲线，并且理论上可以检测样品中的单个目标分子。

用于突变筛查的数字PCR方法

现在我们已经介绍了数字PCR的工作原理，让我们解释一下什么样的分析可以用来嗅出您想要的突变。您将使用的分析与实时PCR中常用的传统双链引物探针分析没有太大区别。这些分析可以设计为检测通过ho整合的供体序列燃烧定向修复(HDR） (1.)，或由非同源端连接引起的indel突变(NHEJ） (2.-5.)，这取决于你想要的基因组编辑。

由于开发NHEJ生成翻译阅读框改变索引以“功能敲除”感兴趣的基因是精确基因组编辑最常见的应用之一，本文的剩余部分将集中于检测NHEJ的检测方法。这些检测包括一个正向和反向引物来扩增目标位点，以及一个设计用于结合在未编辑位点的参考探针远至预测的双链断裂，以及设计用于结合的NHEJ/“drop-off”探针直接在预测的双链断裂位点(图2A)。

数字PCR的单分子分辨率允许根据单个目标分子的突变状态对其进行分类。脱落探针被设计成完美地补充野生型序列，并且不能结合突变的靶点。可以快速计算每个样本中突变和野生型靶标的数量（详情见[2.])作为精确基因组编辑工作流程的一部分，可用于量化批量或单细胞衍生基因组DNA样本中的突变率。

数字PCR与其他验证方法的比较

如前所述，这些检测方法与常用的不匹配核酸酶检测方法相比有几个主要优点。

1. 灵敏度:少于20 ng的总gDNA足以进行分析。我们已在未事先定量的情况下，从96孔板的单个孔中成功分析了数千个细胞的gDNA。相比之下，错配分析需要200至500 ng的gDNA纯化PCR产物。
2. 低检测限：数字PCR分析可以在野生型靶标的高背景下准确定量低水平的突变靶标（低至20 pg或0.02%）。相比之下，错配核酸酶分析的检测限约为5%(2.,6.,7.）．
3. 区分单等位基因突变和双等位基因突变的能力：也许数字PCR分析最值得注意的优点是，在筛选克隆以完成目标基因功能敲除时，它们能够轻松区分具有单等位基因突变的单细胞衍生样本与具有双等位基因突变的样本。错配核酸酶分析完全是“盲”的这是一个非常重要的区别（图3）。

如果你有兴趣利用数字PCR筛查的力量来验证你的基因组编辑，这篇论文提供关于如何设计此类分析的详细说明，以及测试它们的性能(2.)。请记住，尽管数字PCR是一个很好的筛查工具，但它仍然需要目标DNA测序来确认突变的确切性质。可以找到大量可用测序选项的详细说明在这里．祝你的基因组编辑好运，愿你所有的NHEJ突变都脱离框架!

斯科特·芬德利，阿尔伯塔大学博士后。他对分子生物学的一切都感兴趣。在推特上关注他@另一只大白鼠．

参考文献

1.Miyaoka Y。等无抗生素选择分离单碱基基因组编辑的人类iPS细胞。纳他美11,291 - 293(2014)。PubMedPMID: 24509632公共医疗中心PMCID: PMC4063274．

2.芬德利，文森特，K. M.，伯曼，J. R. &波斯特维特，l . M.。基于数字pcr的高效和高特异性筛选基因组编辑细胞的方法。公共科学图书馆一号11,e0153901-17(2016)。PubMedPMID:27089539．PubMedPMCID:PMC4835065．

3.Mock，U.，Hauber，I.&Fehse，B.数字PCR评估由设计核酸酶介导的基因编辑频率（GEF-dPCR）。Nat Protoc11,598-615（2016），公共医学杂志采购经理人指数：26914317．

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7.T7E1和surveyor错配切割检测工程核酸酶引发的突变的比较。G3（贝塞斯达）5.407 - 415(2015)。PubMedPMID: 25566793公共医疗中心PMCID:pmc349094．