这篇文章是由剑桥大学生物化学博士研究生Søren Hough撰写的。
CRISPR实验过程中最重要的步骤之一是验证编辑。无论你使用哪种CRISPR基因组编辑系统，观察到的表型都有可能是由脱靶突变引起的，而不是靶基因的编辑。验证过程也称为CRISPR基因分型，对于证明基因型和测定的表型之间的因果关系至关重要。验证这些连接可以帮助缓解再现性危机在生物学。随着CRISPR在生命科学领域的应用越来越多，解决这些问题是关键，并为学术界、工业界，特别是临床建立标准化的验证技术。
流行的验证方法是不够的
如中所述CRISPR 101：验证您的基因组编辑，CRISPR基因分型有多种选择。最常见的选择包括错配切割分析，如™, 然而，最近的研究表明，这两种方法™ Sanger可能不是验证编辑的适当标准。
错配切割分析依赖于宿主DNA的编辑链和野生型链之间的配对。当这些链杂交时，核酸酶可以检测到不匹配的链并裂解它们。然后用凝胶电泳将结果可视化。
Surveyor™和T7E1因其相对简单、成本低而被广泛采用。这些分析的问题是它们不能提供序列水平的数据。它们的检出限为~5%。这意味着，它们不能可靠地检测不到5%的编辑事件(Fu等人，2013年，Vouillot等人，2015年）.
同时，Sanger测序费时费力，不能应用于异质群体(Bell等人，2014年).此外，Sanger测序的检测限较低，为50-20%（尽管在一些研究中有所改进）(戴维森等人，2012年，Tsiatis等人，2010年）.随着该领域向验证CRISPR实验的标准化门槛迈进，许多人开始转向下一代测序方法，而不是旧的分析方法。
有偏见的测序方法
有两种主要的非靶点检测方法：有偏检测和无偏检测。有偏检测技术仅对基因组中预测包含非靶点切割事件的某些位点进行测序。无偏检测技术在整个基因组中搜索非靶点，而不考虑生物信息学预测。
这些技术在重要方面有所不同，但也可以通过提供基因组测序的广泛和具体细节相互补充。如果配合使用，这些方法可以为研究人员提供合理水平的信息，确保他们看到的效果不是由于偏离目标造成的。这是提高研究结果可信度和再现性的重要一步。
表1:有偏见的基因分型选项
| 技术 | 序列信息 | 检出限 | 优势 | 缺点 |
| 乳沟不匹配分析 | 未提供 | 5% | 便宜,简单 | 低吞吐量、低灵敏度 |
| 桑格测序 | 假如 | 20%(变量) | Sequence-level数据 | 低通量，不适合异质人群，低敏感性 |
| 有针对性的扩增子测序 | 假如 | 0.01%(变量) | 序列级数据，非常敏感 | 不排序所有的dsb，可能错过不可预测的脱靶中断 |
预测算法:一个很好的地方开始有偏差的验证
目前,许多软件工具使用计算方法预测sgRNA的非靶向效应。它们识别基因组中可能的非靶向位点，并根据基因组和sgRNA的序列精确定位错配的位置。这对大多数研究人员来说是一个很好的起点，因为它提供了一个假定的非靶向位点列表，他们可以在以后对其进行测序塔提斯。
在CRISPR实验后，研究人员可以使用一种方法来测试预测的脱靶位点，即靶向扩增子测序。靶向扩增子测序的信息非常敏感，检测水平低至0.01% (Hendel et al. 2015).低检测率意味着研究人员可以相对确定，如果使用这些技术仍然未被检测到，他们的样本不会发生脱靶突变。
脱靶突变的频率是研究人员确定基因型和表型之间联系的关键数据点。当翻译研究者开始使用CRISPR作为治疗手段时，进行这些验证也很关键。低频脱靶效应在研究环境中可能产生不可重复的数据，但这些事件可能在临床中产生灾难性的健康影响。基于ngs的方法提供了关于假定的脱靶位点的最完整的信息概要，包括编辑率和修复产品序列。
靶向扩增子测序并不能说明一切
尽管脱靶预测算法已经取得了进展，但它们的全基因组搜索标准并不全面。错配公差设置通常局限于<4 bp的脱靶位点。由于末端3’PAM位点的序列要求更严格，脱靶序列通常也由沿gRNA长度失配的位置加权(Fu等人，2013年；Pattanayak et al. 2013）.
这种方法忽略了更大的错配(例如六个核苷酸)，这些错配仍然可能导致脱靶双链断裂(Tsai et al. 2015)此外，目前的算法没有考虑其他因素，包括与DNA结构相关的因素（如表观遗传修饰、凸起），这些因素也可能影响非目标编辑。因此，只有通过传统算法预测的测序位点可能无法提供模型细胞系或生物体中CRISPR编辑影响的全貌。
有几种无偏离目标检测选项，包括Digenome seq(Kim等人，2015年)体外分析,IDLV体内检测(Gabriel et al. 2011，Wang et al. 2015，Osborn等人，2016年)及公路服务站(Frock等人，2015年)用于基于细胞的实验。这些策略可以配合使用生物信息学预测以创建更全面的脱靶编辑事件列表。两种最常见的基于细胞的方法是全基因组的、无偏性的双链断裂鉴定(DSBs)，通过测序(GUIDE-seq) (Tsai et al. 2015)和直接原位链霉亲和素的标记、富集和下一代测序(BLESS) (克罗塞托等人，2013年）.
GUIDE-seq和BLESS检测双链断裂，不需要高测序读数，使它们在许多实验室中快速和可行的多路测序选择。然而，无偏检测不如靶向扩增子测序灵敏。例如，guide_seq的最低检测限似乎为0.1% (Tsai et al. 2015）.这与扩增子测序中0.01%的检测频率(Hendel et al. 2015)，随着CRISPR实验越来越接近临床(2016年）.
表2：无偏基因型选择
| 技术 | 检出限 | 应用程序 | 优势 | 缺点 |
| GUIDE-Seq | 0.1% | 基于单元的 | 在基因组中搜索所有DSB，不需要高读取计数和快速多路复用 | 需要交付dsODN（潜在有毒） |
| Digenome Seq | 0.1% | (游离体外) | 适用于所有单元格类型 | 必须使用基于单元的方法进行验证 |
| IDLV | 1% | 基于单元的 | 可编程，可检测活细胞中的dsb | 不像其他公正的方法那样敏感，背景高 |
| 祝福 | 没有报告 | 细胞(体外) | 可用于全动物模型的组织，不需要外源性成分(如dsODN)，不需要高读计数(快速多路复用) | 需要大量的细胞，对细胞固定后的时间很敏感 |
| HTGTS | 没有报告 | 基于单元的 | 标识易位 | 受染色质结构的限制，产生许多假阴性 |
结合测序技术可以保证实验的有效性
不偏不倚的检测方法对于在整个基因组中发现DSBs的证据是极好的。然而，灵敏度的降低意味着最好的选择可能是整合有偏见和无偏见的方法。正如泰科等人，2016年，公正的排序和生物信息学预测应该给出基因组中所有可能的编辑事件的概貌;在此基础上，扩增子测序可以以高度精确的方式评估和验证脱靶位点。
使用这两种方法可能不是每次CRISPR实验都必须的。由于>3 bp错配或序列无关的脱靶事件是罕见的，但它们可以通过全基因组无偏性方法检测到。然而，大多数研究人员使用单细胞克隆体外CRISPR实验。从池中派生的单个细胞克隆同时包含罕见的脱靶事件和所需编辑的可能性很低。因此，当选择单个克隆时，无偏置测序可能不值得花费和劳力。相反，转译研究可能需要两种形式的脱靶分析的严格性，以满足临床批准。
维持一套一致的标准是关键，因为该领域寻求生成有关生物系统中遗传网络作用的可复制、高质量的数据。NGS还将在临床治疗发展领域发挥重要作用，因为CRISPR不仅用于研究疾病，还用于治疗患者。有关更多信息，请参阅d关于上述测序技术的详细概述，请参见“优化CRISPR-Cas9基因组编辑特异性的方法”Tycko等人，2016年以及“定义和改进CRISPR–Cas9核酸酶的全基因组特异性” 通过2016年．
非常感谢我们的客座博主Søren脚腕。我们还要感谢Monica Sentmanat、Victor Dillard和Ayokunmi Ajetunmobi对这项工作的贡献。
索伦·霍夫是剑桥大学格登研究所史蒂夫·杰克逊教授实验室的生物化学博士候选人。在实验室之外，他是一名自由记者和科学作家，专注于如何利用科学创造一个更公正、更公平的社会。阅读更多https://magazine。
参考文献
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