最初发布于2016年8月16日，最后更新于2020年8月6日，由Jennifer Tsang发布。
当我们谈论CRISPR的应用时，一个负面的东西经常出现:低编辑效率homology-directed修复(HDR)．相比非同源末端连接HDR的发生频率相对较低，在非分裂细胞中，该途径进一步下调。科学家们没有试图改善HDR，而是开发了两类碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。
(也有RNA碱基编辑器，但我们这里只讨论DNA碱基编辑器。想要了解更多关于RNA碱基编辑器的知识，请访问这篇博文:CRISPR 101：用Cas13编辑RNA）
碱基编辑器可以编辑什么碱基?
CBEs介导C到T的变化(或者在相反的链上G到a的变化)。ABEs使A到G的变化(或在相反的链上T到C的变化)。这只解释了12种可能的变化中的4种。
最近的发展主要编辑，它使用与CBEs或ABEs不同的机制大卫刘的实验室使得科学家们能够完成所有12种碱基之间的变化。
基本编辑器是如何工作的？
基础编辑需要三个元素。广泛:
- 一种Cas-nickase或Cas融合到脱氨酶中，使之成为酶
- 将Cas靶向特定位点的gRNA
- 在Cas指定的编辑窗口内进行编辑的目标碱基
这些元素是Alexis Komor博士后开发的第一批胞嘧啶碱基编辑器和第一批腺嘌呤碱基编辑器的起点妮可Gaudelli2016年在David Liu的实验室。
胞嘧啶基地编辑
胞嘧啶碱基编辑的开始
科莫创造了第一个胞嘧啶碱基编辑器通过将胞苷脱氨酶与失活的dCas9偶联(Komor et al.， 2016)。这些融合在不切断DNA的情况下将胞嘧啶转化为尿嘧啶。尿嘧啶随后通过DNA复制或修复转化为胸腺嘧啶。将尿嘧啶DNA糖基化酶(UGI)抑制剂与dCas9融合可防止碱基切除修复，从而将U突变变回C突变。为了提高碱基编辑的效率，你需要一种方法迫使细胞使用脱胺DNA链作为模板。为了做到这一点，实验室使用了Cas nickase，而不是dCas9。由此产生的编辑器BE3将未修饰的DNA链剪开，使其在细胞中看起来像是“新合成的”。因此，细胞使用含有u的链作为模板，复制碱基编辑，修复DNA。
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| 胞苷脱氨基作用发生在DNA的游离链上，并将C转化为U，而不会产生双链断裂。 |
BE3系统将人类细胞系中多种靶标的编辑频率提高到30%以上，而平均indel频率仅为1.1%。对于测试的基因座来说，这些数字比cas9介导的HDR有了巨大的进步，平均HDR介导的编辑频率只有0.5%，而且观察到的插入比点修饰更多。CRISPR碱基编辑通过多次细胞分裂持续，表明这种方法产生稳定的编辑。然而，该系统也受制于基于Cas9脱靶活性的脱靶编辑。
提高胞嘧啶碱基的编辑范围和效率
自BE3开发以来，许多研究小组对基础编辑器进行了改进，包括：
- 扩大目标范围
- 提高编辑效率
- 减少非目标效应
在2016年,Akihiko近藤的实验室创建了目标援助基本编辑器使用七鳃鳗细胞胞苷脱氨酶与Cas9-nickase融合（Nishida等人，2016年）。Target AID的作用与BE3类似，但不完全相同，修改了PAM上游18个碱基的3-5碱基窗口。
David Liu的实验室用其他脱氨酶生成了BE3变体:AID、CDA1和APOBEC3G (Komor等人，2017年).CDA1-BE3和AID-BE3比BE3更有效地编辑G后的Cs，但APOBEC3G显示的序列首选项不太可预测。
刘实验室还使用自然和工程Cas9变体进行开发5个具有不同PAM序列的新碱基编辑器，扩大了碱基编辑可用目标站点的数量(Kim et al.， 2017)。对于每个碱基编辑器，他们观察到的编辑活性最低效率为50%，并证实融合蛋白保留了Cas9个体的PAM特性。他们还对碱基编辑器的胞苷脱氨酶部分进行诱变，以创建SpCas9碱基编辑器，其编辑窗口小至1-2个核苷酸。
为了减少与基础编辑相关的偏离目标的效果，实验室创建了HF-BE3，一个包含高保真Cas9变体HF-Cas9（Rees等人，2017年）。HF-BE3的靶外编辑比BE3少37倍，靶内编辑效率仅略有降低。为了进一步提高特异性，他们纯化了HF-BE3蛋白，以核糖核蛋白颗粒（RNPs）的形式输送到斑马鱼胚胎和小鼠内耳。
第四代基本编辑
的第四代基本编辑，BE4，减少BE3可能发生的不需要的C->G或C->A转换。T这些副产物可能是在碱基切除修复过程中通过尿嘧啶N-糖苷酶（UNG）切除产生的。添加第二份UNG抑制剂UGI可提高碱基编辑产品纯度。该实验室还扩展了APOBEC1-Cas9n和Cas9n UGI连接器以提高产品纯度，这三项改进代表了第四代碱基编辑器。与BE3相比，BE4的C->G和C->a产物减少了2.3倍，indel形成减少了2.3倍。
为了进一步减少indel形成1.5-2倍，该团队融合了噬菌体蛋白Gam到BE4的n端(Komor et al.， 2017)。Gam结合dsb的游离端，这可能导致细胞死亡而不是NHEJ修复，从而将这些细胞从编辑群体中移除。
提高哺乳动物编辑碱基编辑效率的另一种方法是确保编辑器能进入细胞核，并且表达良好。刘实验室修改了核定位信号和密码子用法BE4创建BE4max和AncBE4max编辑效率提高4.2-6倍(Koblan et al.， 2018)。
腺嘌呤基编辑
腺嘌呤碱基编辑的开始
David LIu实验室的Nicole Gaudelli发明了一种腺嘌呤碱基编辑器将腺嘌呤转化为肌苷，导致A到G的变化(Gaudelli等人，2017)。创建腺嘌呤碱基编辑器需要一个额外的步骤，因为没有已知的DNA腺嘌呤脱氨酶。他们使用定向进化从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA中创造了一个。
经过七轮分子进化，他们获得了四个腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。ABE7.10是最活跃的编辑器，在目标位置4-7的编辑窗口中显示53%的平均编辑效率。ABEs 6.3、7.8和7.9显示位置4-9的编辑窗口略宽，但位置8和9的编辑效率可能较低。虽然胞嘧啶碱基编辑通常产生混合的编辑群体，但ABE在靶基因座上不显示显著的a到非G转换。从DNA中去除肌苷的情况可能很少，因此阻止了碱基切除修复的诱导。
在脱靶效果方面，ABEs也优于其他方法。与Cas9相比，Cas9以14%的indel率修改了9/12已知的脱靶率，而ABE7.10只修改了4/12脱靶率，频率为1.2%。尽管该实验室没有对ABE的特异性进行全面的全基因组研究，但他们的其他实验表明，ABE是健壮而特异的编辑器。
改进腺嘌呤碱基编辑
Liu实验室在创建上述BE4max和AncBE4max时，也制作了一个腺嘌呤碱基编辑器，改进了核定位和表达。这个碱基编辑器被命名ABEmax．
2020年，发表了两篇论文，描述了从ab7.10进化而来的其他ABEs，它们提高了碱基编辑器定位的灵活性和特异性。在这第一项研究中，Liu实验室使用噬菌体辅助进化选择系统来生成ABE8e（TadA-8e V106W）,这编辑速度比ab7.10的TadA快约590倍不增加脱靶活动(Richter et al.， 2020)。这很重要，因为阿贝斯的动作通常很慢这意味着，在进行编辑之前，Cas9结构域通常会释放DNA。
以abc7.10为起点，高德利将碱基编辑器进化成40个新的ABE8变种(Gaudelli et al.， 2020)。ABE7.10相比,ABE8s与ABE7.10相比，NGG PAM原间隔位A5-A7位点的编辑效率提高了1.5倍，A3-A4和A8-A10位点的编辑效率提高了3.2倍，非NGG PAM位点的编辑效率提高了4.2倍。ABE8s有一个改进的基础编辑能力，甚至在以前难以瞄准的网站。ABE8s能在原代T细胞中实现98-99%的靶向修饰，使原代T细胞具有特异性细胞治疗应用的有前途的工具．
双基地编辑
把两种编辑器的功能合二为一怎么样?这是最近通过将腺嘌呤和胞嘧啶编辑成分融合在一起完成的。
基思·荣格的实验室发明了一种双脱氨酶编辑器空间(同步可编程腺嘌呤和胞嘧啶编辑器)将miniABEmax-V82G和Target-AID融合到Cas9上(Grünewald et al.， 2020)。另一个实验室采用了类似的方法。Dali Li实验室的A&C-BEmax由一个胞苷和腺苷脱氨酶的融合与Cas9 nickase结合(Zhang et al.， 2020)。与ABEmax相比，它增加了CBE活性，降低了RNA非靶向活性。
基础编辑出版物亮点
在下表中，您可以找到我们在本文中强调的出版物列表。
| 出版 | 质粒 | 突出了 |
| Komor等人，2016年 | BE1、BE2 BE3 | BE3的编辑效率最高，但其indel形成比BE2高 |
| Nishida等人，2016 | 目标援助 | 在PAM上游的-18位置周围编辑3-5个基本窗口 |
| Kim等人，2017年 | SaBE3、BE3 PAM变体、BE3编辑窗口变体 | 大大扩展了用于碱基编辑的目标位点的数量 |
| Rees等人，2017年 | HF-BE3 | HF-BE3和核糖核蛋白传递降低BE3的脱靶活性 |
| Komor等人，2017年 | BE4 BE4-Gam;AID、CDA1和APOBEC3G BE3变体 | UGI的第二个副本提高了产品纯度。Gam降低了indel频率。 |
| Koblan等人，2018年 | BE4max、ArcBe4max ABEmax | 改进的核定位和表达 |
| Gaudelli等人，2017 | 腺嘌呤碱基编辑器(ABE7.10) | A- >i (A->G)编辑，产品纯度高，脱靶编辑低 |
| Richter等人，2020年 | ABE8 | 腺嘌呤碱基编辑速度比ABE7.10快590倍 |
| 高德利等人，2020年 | ABE8e | 有效的初级单元格编辑 |
| Zhang et al.， 2020 | A&C-BEmax | 具有胞嘧啶和腺嘌呤碱基 |
| Grünewald等人，2020年 | 空间 | 具有胞嘧啶和腺嘌呤碱基 |
詹妮弗·曾荫权为更新这篇文章做出了贡献。
参考文献
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