PCR定点突变

这篇文章由康奈尔大学的客博主克里斯蒂安·劳森撰稿。

位点定向突变是一种高度通用的技术，可用于引入特定的核苷酸替换(或缺失)，以量身定制的方式。该方法可用于传统的克隆(引入或去除限制性位点)，调控元件的定位(在报告基因中突变启动子/增强子)，蛋白质功能分析(进行丙氨酸扫描突变或关键残基的靶向替换)，以及SNP分析(在质粒中引入自然发生的SNPs)。这项技术也与当今时代息息相关CRISPR; 定点突变通常适用于质粒，但也可能有助于基因组编辑。定制突变通常通过CRISPR/Cas9诱导的双链断裂的同源性定向修复（HDR）引入内源性DNA。这种位点导向的基因组编辑需要一个与内源性靶点高度同源的模板，但为了促进修复，模板应能抵抗Cas9切割。如果质粒含有模板，则可使用定点突变来突变PAM序列（对Cas9切割至关重要的NGG序列），从而使所得构建物抵抗Cas9诱导的切割。

位点定向诱变综述

简而言之，利用引物(带有想要的突变)可以将点突变引入质粒中PCR协议这放大了整个质粒模板。父模板将使用甲基化依赖性核酸内切酶（即DpnI），细菌用耐核酸酶的缺口质粒（PCR产物）转化。从产生的菌落中分离质粒，并筛选所需的修饰。最后，对阳性克隆进行测序，以确认所需的修饰和附加修饰的缺失。

质粒的定点突变。A)突变质粒的产生。PCR引物(绿色)扩增质粒模板(蓝色)，并引入一个限制性位点“a *”(除了原载体中已经存在的“a”位点)。图中还显示了目标区域侧翼的“B”限制位点。PCR扩增后，用DpnI酶切去除模板，只留下突变质粒。尽管人们普遍认为PCR反应的最终产物是带有交错裂口的双链环状DNA片段，但最近的数据(见Xia et al.， 2015)表明，最终的PCR产物是带有同源末端的线性双链DNA片段。这些同源末端在体内重组，形成如图所示的最终圆形质粒产物。B)对恢复的质粒进行感兴趣突变的筛选。左为预期限制性内切分析结果的凝胶电泳图，右为限制性片段长度多态性(RFLP)分析的验证PCR图。与亲代质粒酶切产物(蓝色)相比，当位点定向突变产物(绿色)被酶切时，限制位点“A*”的引入会产生额外的条带。 Digestion with enzyme “B” detects primer multimerization (purple) which is evident by an increase in the size of the lower band (portion of the plasmid containing the mutation). Similar results can be obtained with PCR screening using the primers specified by the arrowheads in (A).

实验指南

引物设计

根据经验，在期望突变的任意一侧(通常是1-3个不匹配的碱基)，11 bp的互补序列足以让你的引物在PCR反应中成功退火到感兴趣的质粒。理想情况下，你的引物应该没有回文和重复序列，但如果存在，一个小的扩展通常可以确保3 ' -碱基(s)不形成二级结构。通过诱变引入(或消融)限制位点极大地促进了后续筛选成功突变克隆的过程。正向引物和反向引物的设计是互补的，但只要保持至少6bp的重叠，每个引物都可以延伸到互补区域之外。这种重叠确保了PCR产生的是一个缺口圆形而不是线性产物(见图)。

模板

高纯度的质粒制备显著提高了位点定向诱变的成功率。此外，您可能需要尝试不同浓度的模板(例如0.1-1.0 ng/μl)。小的质粒(~ 3kb)通常比大的质粒更有效地扩增，但大到6kb的质粒通过简单地遵循聚合酶制造商的PCR协议也可以相当容易地扩增。请确保调整扩展时间以匹配模板的大小。在PCR反应中加入DMSO(通常最终浓度约为3%)有助于GC-rich质粒的扩增。DMSO降低了DNA模板的二级结构，也可能降低引物的退火温度。因为你将使用甲基化依赖酶(DpnI)从PCR产物中消除母质粒，因此应该从甲基化活性菌株(例如DH5α，即dam+)中分离出质粒模板。甲基化缺陷菌株可以通过dam13(-)突变来识别——在准备用于位点定向突变的质粒模板时，您将希望避开这些菌株。

聚合酶

为了确保在PCR过程中不会引入不需要的突变，需要高保真度聚合酶。市场上有许多高纯度的聚合酶；您需要一个具有5'->3'聚合酶活性（用于扩增）、3'->5'核酸外切酶活性（增加扩增保真度）和无5'->3'核酸外切酶活性（可能截断模板）的模板。重要的是，您还需要一种DNA聚合酶来产生钝端PCR产物（例如Phusion、Pfu和Vent聚合酶）。请注意，某些聚合酶（如Taq）会产生A-外伸（TA克隆中使用的一个特性）。这种3'端的非互补碱基干扰质粒重组，因此Taq聚合酶不能用于定点突变。

核酸酶

为了去除模板DNA(未修饰的质粒)，使用了DpnI酶切酶切。DpnI的独特之处在于，它只切割在GATC识别位点的腺苷上甲基化的DNA。

转型: PCR反应后，无需连接大肠杆菌你将聚合酶链反应产物转化成能有效修补DNA的物质。的抗性标记从亲本质粒中选择携带突变质粒的转化子的方法。注意，在这些条件下，任何残留的亲本质粒（通常来自不完全的DpnI消化）也可以形成菌落。

筛选

如果限制位点被引入(或消融)，则可以通过片段长度多态性(RFLP)分析确定该特定位点的存在(或不存在)来筛选菌落。在这个过程中,如果你的网站到你的质粒突变引入了额外的限制,然后,当质粒与合适的限制性内切酶消化,在凝胶上运行,一个乐队出现在消化产品的修改的质粒会分裂成两个较小的乐队(图B,消化)。相比之下,如果你的突变消融了一个限制位点，用适当的酶进行消化，就会将未修饰的质粒的两个可见的小带合并成一个更大的带(未显示)。作为一个脚注;类似的方法可以用于识别Cas9/ crispr诱导的基因组修饰．

偶而，PCR引物的多聚反应会导致引物序列在最终质粒中的重复。另一项限制性摘要切除靶位点近端一个短区域(<400 bp)，可以识别这些重复(相对于原始模板略大的条带大小)。由于大小差异较小，碎片应在高百分比琼脂糖凝胶上分离(~3%)。注意，引物重复在最初的RFLP分析中会逃避检测，因为引入的限制位点也重复了。

验证你的突变质粒

一旦确定了含有所需修饰的结构（并确认没有引物重复），由测序包含插入的质粒的功能区域。这是必要的，因为突变可能被引入质粒的任何地方(尽管频率极低)，这可能会干扰最终构建的功能。如果功能重要的区域跨越了几个kb(或者是gc丰富的区域，因此很难进行排序)，那么后续处理可能更容易克隆进入亲本质粒(或其他质粒)的较小区域(包含特定修饰)。这在具有多个功能区域的大型质粒的情况下尤其相关作为突变反应的模板。

定点诱变的替代方法

点突变是相当容易的，但是如果你想在一个大的结构中引入点突变，PCR引入突变的风险可以使替代方法更加有利。特别是，如果一对独特的限制性位点位于你的目标位点附近，你可以简单地用一对产生线性产物的引物扩增和突变质粒的这一小部分。然后可以使用独特的限制性位点将突变产物克隆回原始质粒。或者，如果你想让你的蛋白质失去功能，你可以简单地引入一个移帧突变。这可以通过使用一种限制性内切酶来实现，该限制性内切酶可以识别编码区中的一个独特位点（最好靠近5’-端），并且还可以产生4个bp的悬垂。然后，你可以使用DNA聚合酶I的Klenow片段从这些突出部分生成钝端，并在标准连接反应中将这些钝端连接在一起，从而产生一个帧移位编码区。值得注意的是，与这些替代方案不同，通过PCR进行的定点突变不依赖于独特位点的接近程度，并且允许引入专门设计的突变（不限于移码突变）。因此，定点突变是对质粒模板进行微小修饰的最常用方法之一。

非常感谢我们的客座博主Kristian Laursen!

克里斯蒂安·劳尔森(Kristian Laursen)是康奈尔大学的研究员。

参考文献

1.等。"从碱基序列预测DNA双工稳定性"美国国家科学院院刊83.11 (1986): 3746-3750. PubMedPMID: 3459152．公共医学中心PMCID: PMC323600．

2.切斯特，尼古拉斯和丹尼尔·r·马沙克。二甲基亚砜介导引物Tm还原:一种在聚合酶链反应中分析复性温度作用的方法。分析生物化学209.2(1993): 284 - 290。PubMed PMID: 8470801。PubMedPMID:8470801．

3.等。"引物定向DNA酶促扩增"科学239(1988): 487 - 491。PubMedPMID: 2448875．

4.Xia，Yongzhen，et al.“对QuikChangeTM过程的新见解指导了使用Phusion DNA聚合酶进行定点突变。”核酸的研究(2014): gku1189。PubMedPMID: 25399421．公共医学中心PMCID:pmc433370．

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