有些人喜欢热的：耐高温的GeoCas9

贝丝·肯克尔

Beth Kenkel.2017年9月14日

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Cas9.是许多模型生物选择的基因组编辑工具：哺乳动物细胞那酵母那果蝇那植物那蠕虫那斑马鱼那青蛙那一些细菌;但不嗜热（高热爱）细菌。直到最近，唯一可用的CAS9蛋白质从嗜苯胺（中等热爱）细菌中分离，例如链球菌蟒蛇'spcas9。这些Cas9蛋白质在高温下不起作用，因此在蒸发器中使用它们，细菌必须在较低的温度下种植这种方法只适用于兼性嗜热菌（高或中等嗜热菌），但不适用于专性嗜热菌。然而，最近Doudna Lab.已经开辟了嗜热细菌领域，以CRISPR / CAS9基因组编辑。

Geocas9如何发现？

Geocas9的发现始于一个有趣的问题：为什么工程师一个新的Cas9，当你能找到一个自然发生的？这与用于制造的工程方法不同ESPCAS9和SPCAS9-HF1。通过挖掘天然存在的Cas9多样性的宝库积分微生物基因组（IMG）数据库那Harrington等从嗜热细菌发现了Cas9蛋白嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geocas9）。G. StearotherMophilus.在30-74°C的温度范围内生长，最佳生长温度为55°C。对于Geocas9与SPCAS9的简要比较，请参阅下表和阅读有关Geocas9的更多信息。

	SPCAS9.	Geocas9.
尺寸	1368 AA.	1087 AA.
PAM序列	NGG	克拉（r = a或g）
垫片长度	20 NT.	22 NT.
最佳活动的温度范围	35 - 45°C	50 - 70°C
基因组在哺乳动物细胞中编辑？	是的	是的
血清中的寿命？*	不	是的

表1. SPCAS9和Geocas9比较。*用于体外Cas9的RNP活动或长寿。

Geocas9在高温下活跃

SPCAS9 VS Geocas9的稳定性“width=

Geocas9的关键优势在于它在温度温暖的温度比SPCAS9上的功能可以耐受。Harrington等，以两种方式测试了Geocas9对热量的热爱。第一组实验测试了Geocas9的能力rnps.在高温下孵化，但热处理后仍保持活性。第二组实验测试了GeoCas9 RNP在高温下进行反应时切割底物的能力。在这两种情况下，GeoCas9在高温下的表现都优于SpCas9。实验结果汇总见图1。

哺乳动物细胞中的Geocas9 RNP编辑

除了能够吸收一些热量之外，Geocas9可以在哺乳动物细胞中引入基因组编辑。Harrington等，通过使用Geocas9或SPCAS9 RNP转换HEK293单元格和针对具有重叠PAM的网站的指导来测试Geocas9的编辑技巧。在这两种情况下，Geocas9和Spycas具有相似的编辑水平。在Harrington等，请参见到HEK293的Geocas9编辑活动的更多例子。

人类血浆的Geocas9稳定性

GeoCas9的最后一个诀窍是它在人类血清中的寿命延长。Harrington等人怀疑GeoCas9可能具有更高的稳定性先前的研究研究表明，一种被设计成提高热稳定性的可卡因酯酶在人类血液中的寿命也更长。为了测试GeoCas9是否也是如此，Harrington等人在37°C下将SpCas9和GeoCas9 RNPs在稀释的人血浆中培养8小时。然后添加底物并测量酶活性。SpCas9被10%的血浆抑制，但GeoCas9在高达30%的血浆中保持活性。

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