这篇文章是由Guest Blogger提供的贡献James D. Fessenden是Brigham和女性医院的助理教授。

生物化学家通常很难理解感兴趣的蛋白质的实际行为。它有多大？当你给它添加底物或添加必要的辅因子时，它的哪些部分会移动？它有多少结合伙伴，它们在细胞环境中是如何起作用的？如果这些是你实验室的紧迫问题，那么微动实验是一个可行的答案的生物物理途径。

什么是FRET，它有什么好处?

荧光共振能量转移（FRET）是两种荧光团之间的生物物理相互作用。当第一荧光团（）捐赠者）兴奋，它可以直接通过对第二荧光团的共振直接转移能量（受体）如果两个探针靠近（通常为30-100埃，则根据探针）。事实上，FRET可用于导出供体/受体荧光团之间的精确物理距离（斯特里尔，1978年），一种不受干预蛋白质，脂质双层，细胞器或其他细胞障碍影响的测量。

FRET已用于许多应用，包括大型制药公司（即HTRF和LanthaScreen）的药物发现(Degorce等人，2009年)，测量细胞内钙(miyaaki, Griesbeck, Heim， & Tsien, 1999），监测激酶活性（NI，TITOV，ZHANG，2006年)，量化抗体/抗原的相互作用(Saraheimo等人，2013年)，并观察蛋白质翻译过程中核糖体的结构变化(Ermolenko等人，2007年).所需要的只是感兴趣的蛋白质/核酸/脂质荧光标记当这些荧光团彼此靠近时，它们就会发生FRET。

如何用FRET荧光团标记感兴趣的生物分子?什么时候需要绝对标记特异性，什么时候不需要?对您的FRET测试进行压力测试以确保其正常工作需要哪些适当的控制?本文将解决这些问题，它们是建立基于fret的分析或筛选的关键(Addgene博客有一个优秀的188博金宝官网FRET底漆以及如何测量它）。

分子邮箱:如何把你的荧光团送到正确的地方?

FRET实验需要将供体和受体荧光团定位到你想测试相互作用的不同生物分子上。事实上，将FRET荧光团定位到生物分子上有点像联邦快递。你的荧光团包裹需要到达正确城市(蛋白质)的正确邮箱(即结合位点)。在细胞中，这项任务更加困难，因为成千上万的生物分子每一个都包含多个结合缝隙，它们可以非特异性地吸收你的荧光团包。

FRET实验设计的一个重要概念是供体和受体荧光团的靶向特异性要求是不同的。捐献者必须被送到一个确切的地点(在你的分子城市的一个特定房子的单个邮箱)。然而，受体不需要去与给体相同的位置。只要一些受体分子被锁定在附近(如与供体在同一条街上的邻近房屋)，那么FRET测量就有可能。事实上，即使大多数FRET受体被送到了不同城市的错误地址，你仍然可以开发一个成功的基于FRET的分析，因为能量转移只发生在供体和受体靠近的时候。远离供体的受体>100 Å的结合不会导致能量转移，因此，你特定的FRET信号不受影响

由于给受体和受体荧光基团靶向特异性的这些基本差异，最好在讨论可用的工具时单独考虑这些情况。让我们先考虑捐赠者首先标记特异性是最重要的。

供体标记和特异性的需要

供体荧光团要去正确的地方。错误定位的供体永远不会“看到”FRET受体，因此永远不会经历FRET。如果这种非特异性标记远远超过了合适的供体/受体对，那么任何可测量的FRET将被大量的未偶联供体所淹没。

将荧光供体靶向蛋白质的最佳方法是将分子直接与蛋白质的肽序列硬化。因此，所有合成的靶蛋白分子含有供体，更重要的是，没有由非特异性供体标记产生的荧光背景。

金宝搏app下载(FPs)是基因编码的FRET供体的金标准(图1)。FP变异的分数，从而为FRET实验提供了广泛的施主荧光波长。然而，请记住，如果你进行FP融合，你将插入大约20- 25kda的蛋白质质量到你的蛋白质中，因此这种庞大的插入所造成的结构变化是不可避免的。FRET研究中大多数FP融合是在目标蛋白的N-或c -末端，但即使这些修饰也会影响某些蛋白质的结构或功能。

你可以使用tRNA抑制技术对其进行位点特异性标记，而不是将庞大的FP插入你的蛋白质中(图1)(Dumas, Lercher, Spicer， & Davis, 2015）.通过使用一种新的氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对，研究人员可以诱引核糖体插入一个荧光标记的氨基酸在一个终止密码子(通常是琥珀色，即UAG)工程到一个所需的位置。在翻译过程中，新的tRNA/非自然氨基酸在核糖体中发现UAG密码子，导致附着的荧光团位点特异性结合。然而，由于tRNA抑制与终止密码子上的自然链终止竞争，这些标记蛋白的表达水平通常很低。此外，还需要对细胞本身的tRNA合成酶进行重大检查，到目前为止，这种方法仅在少数细胞类型中最有效(大肠杆菌和非洲爪蟾蜍卵母细胞主要）。然而，可从沉积的实验室获得TRNA抑制质粒，这些实验室掌握了这种技术，所以它可能值得一试，特别是因为潜在的奖励可能很大：

质粒	tRNA合成酶	表达宿主
PMAH-POLY.	多特异性氨基酰基-TRNA合成酶	哺乳动物细胞
Pdule-abk.	pyrrolysyl-tRNA合成酶的脂肪族二唑嗪氨基酸	大肠杆菌和哺乳动物细胞
Pevol-Pazf.	为p-azido-l-phenylalanine合成酶	大肠杆菌
pEVOL pBpF	为p-benzoyl-l-phenylalanine合成酶	大肠杆菌
PACBAC1.TR4-MBPYL.	吡咯缩基-TRNA合成酶	哺乳动物细胞
pCMV-DnpK	dinitrophenyl半抗原	哺乳动物细胞
帕纳普	Anaprs.	哺乳动物细胞

请注意:这不是一个详尽的列表

受体标记:有时候犯错是正常的

与FRET供体相比，FRET受体标记的绝对特异性对于成功的FRET实验并不总是必要的。如果受体荧光团到达靠近供体的分子邮箱，只要它们超出供体的FRET范围(即>100 Å)，就不会出现错误的传递到细胞中其他位置的问题。研究人员已经开发了广泛的一系列化学标记策略，适合将FRET受体靶向蛋白质(在[yan＆bruchez，2015]）.为了让您开始，呈现了两种稳健的正交标记策略（图1），其可以使用腺体质粒进行。

他的标签试剂

你可能已经在你感兴趣的蛋白质上有一个FRET受体结合位点:只是你还不知道而已!常用于蛋白质纯化的多组氨酸标签与Cy染料氮三乙酸(NTA)结合使用时是一个可靠的FRET受体标记位点(Kapanidis, Ebright， & Ebright, 2001）.这些Cy/NTA缀合物的工作方式与用于蛋白质纯化的NTA-琼脂糖珠相同:NTA与蛋白质上的His标签结合，耦合的Cy荧光团充当FRET受体。通过将两个NTA分子偶联到每个Cy染料上，以及将组氨酸标签的长度从6个残基延长到10个残基，可以增强结合亲和力。虽然这些Cy/NTA缀合物尚未上市，但它们很容易与用于荧光标记抗体的试剂合成，而且使用薄层色谱法纯化是很容易的(费森登，2009）.然而，这些试剂可以非特异性地在细胞中与细胞中的许多内源性生物分子结合，并且它们不能交叉细胞膜，因此它们最好用血浆膜蛋白（例如GPCR，离子通道或细胞表面受体）或与实验permeabilized细胞。

Biarsenical标记试剂

如果您想用FRET受体共价标记细胞内蛋白质，那么纤维蛋白是一个很好的选择。最初由Roger Tsien和Co-Workers开发（Griffin, Adams， & Tsien, 1998)，这些染料是现在商用的卢米奥绿和Lumio红来自Invitrogen（现在Thermofisher Scientific）。这些试剂是非荧光，直到它们结合可以插入目标蛋白中的6-残基四胞嘧啶标签（序列：CCPGCC）。这些试剂的效用是结合是共价的，因此可以将自由染料洗掉．此外,使用含二硫化物的化合物，如英国反刘易斯(which最初发展为治疗重金属中毒在化学战中［Vilensky＆Redman，2003年]). 最重要的是，这些化合物穿过细胞膜，从而实现FRET测量在完整的细胞。的格拉迪亚实验室已经存一个门户矢量Addgene,在哪里你可以插入感兴趣的蛋白质，得到一个c端融合的一个tetracysteine标签。此外，S.Ince这些标签非常小，可以在目标蛋白质中几乎任何所需位置插入它们，尽管预测的非结构化环是最好的，因为这些标签形成β-发夹（Madani等，2009年）.

供体和受体:把它们放在一起

FRET的供体和受体描述 以上可配对在一起 衡量范围 分子距离 (见下表)。 但是，需要适当的控制实验来建立测定的动态范围。 这些实验 包括 产生积极的控制 构造捐献者和的受体荧光团 绑定站点是彼此相邻在同一蛋白质A.消极的控制实验进行捐赠,只有标记的蛋白质，与你的FRET受体孵育。这些实验将 定义 能量传递的最大值和最小值 期待 ， 从而 建立 的FRET分析的动态范围（图2）。

这些标记方法可以自由互换，FRET的新用途正在不断开发中，所以不要害怕尝试新颖的、未发表的标签策略组合．FRET实验设计为创造力和创新提供了自身，有价值的任何NIH赠款申请的商品！使用烦恼,你可能获得一种对蛋白质结构的新理解，可以带来对其生物学的新见解及其行为。请参阅下表对于您可以在您的FRET实验中使用的捐赠者和接受对。

捐赠者	受体	标签	R0（一种）一个	范围（Å）b	应用程序
CFP	卢米奥绿	TC：CCPGCC.	50	40-72	完整的细胞
	Cy3NTAc	保利他	44	35 - 63	质膜蛋白，渗透细胞
	cy5nta.c		32	25-45
GFP（荧光素是相似的）	Lumio红	TC：CCPGCC.	48	38-70	完整的细胞
	Cy3NTAc	保利他	63	50 - 90	质膜蛋白，渗透细胞
	cy5nta.c		43	34-62
YFP	Lumio红	TC：CCPGCC.	54	42 - 78	完整的细胞
	Cy3NTAc	保利他	65	52-94	质膜蛋白，渗透细胞
	cy5nta.c		59	47 - 85

^一个R₀是50%FRET发生时的施主/受主（D/A）距离。

^b范围对应于观测到的FRET效率在80%到10%之间的计算D/A距离。

^CCy3NTA和Cy5NTA结合His标签的方式相似，但R不同₀值，从而实现校准的FRET距离测量(参见Mahalingam et al.， 2014)。

詹姆斯D. Fessenden目前是Brigham和Boston，Ma的Brigham和女子医院麻醉研究部的助理教授。他的兴趣包括开发用于标记试剂的新型荧光工具，并在结构表征骨骼肌收缩中的大离子通道。

工具书类

1.Degorce，François，et al.“HTRF：一种专门用于药物发现的技术——对理论方面和最新应用的回顾。”当前的化学基因组学和转化医学3.1 (2009). PubMedPMID: 20161833．公共医学中心PMCID: PMC2802762．

2. Dumas，Anaëlle，等。“设计逻辑密码子重新分配 - 扩大生物学中的化学。”化学科学6.1（2015）：50-69。英国皇家化学学会．

3.等。用FRET观察溶液中核糖体亚基间的运动。分子生物学杂志370.3 (2007): 530-540. PubMedPMID: 17512008．

4.Fessenden,詹姆斯D。Förster用一种新的位点特异性标记方法测量ryanodine受体1型结构的共振能量转移。《公共科学图书馆•综合》4.10 (2009): e7338。PubMedPMID:19823671．

5.格里芬，B.阿尔伯特，斯蒂芬R.亚当斯和罗杰Y.钱。“活细胞内重组蛋白分子的特异共价标记。”科学类281.5374(1998): 269 - 272。PubMedPMID:9657724．

6.Kapanidis, Achillefs N, Yon W. Ebright和Richard H. Ebright。荧光探针与蛋白质的位点特异性结合:六组氨酸标签介导的荧光标记(Ni2+:氮三乙酸)n-氟铬偶联物。美国化学学会杂志123.48(2001): 12123 - 12125。Journal的美国化学学会．

7.Madani, Fatemeh等。核磁共振波谱法测定的双砷-四环素基元的发夹结构美国化学学会杂志131.13(2009): 4613 - 4615。PubMedPMID: 19281235．公共医学中心PMCID：PMC2735349．

8. Miyawaki，Atsushi等。“使用改进的Cameleons”动态和定量CA2 +测量“。美国国家科学院院刊96.5（1999）：2135-2140。PubMedPMID: 10051607．公共医学中心PMCID:PMC26749．

9.倪，羌，丹尼斯·塔托夫，金章。“用担心记者分析活细胞中的蛋白激酶动力学。”方法40.3(2006): 279 - 286。PubMedPMID: 16908183．

10. Saraheimo，Satu，等。“抗体检测基于时间的荧光释放方法 - 一种新的晶体诊断概念。”《公共科学图书馆•综合》8.5（2013）：e62739。PubMedPMID：23667515．公共医学中心PMCID:PMC3647052．

11史崔尔，卢伯特。“作为光谱标尺的荧光能量转移。”生物化学年度回顾47.1(1978): 819 - 846。PubMedPMID:354506．

12. Vilensky，Joel A.和肯特雷德曼。“英国抗Lewisite（Dimercaprol）：历史悠久。”急诊医学年鉴41.3 (2003): 378-383. PubMedPMID:12605205．

13.燕，齐和马塞尔·布鲁克斯。“活细胞中蛋白质化学标记的进展。”细胞和组织研究360.1（2015）：179-194。PubMedPMID: 25743694．公共医学中心PMCID:PMC4380784．

参考资料在Addgene博客188博金宝官网

• 得到在实验中使用FRET的技巧
• 当心荧光蛋白聚合
• 温习你的荧光蛋白基础知识

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