定义蛋白质用途的一种方法是通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)。这些相互作用通常被建模为二元关系，即蛋白质A与蛋白质B相互作用;但蛋白质是社会生物分子。它们可以是具有不同功能的多个动态和重叠综合体的一部分。现有的许多鉴定ppi的方法，如亲和纯化质谱法(AP-MS)，都缺乏特异性识别与特定蛋白质复合物而不是单个蛋白质相互作用的蛋白质的能力。的白求恩实验室通过创造克服了这个限制吗Split-BioID，一种时空可控的邻近依赖生物素化技术仿生. Split BioID的关键优势在于，它允许验证二元PPI以及识别其他相互作用因素。
研究蛋白质相互作用的现有方法存在的问题
- 难以检测微弱和/或瞬态PPIs。许多PPI鉴定技术依赖于蛋白质相互作用者在整个下拉步骤中与诱饵蛋白保持密切接触，如AP-MS。这一要求通常会阻止弱的和/或短暂的相互作用蛋白的识别。
- 没有时空的控制。许多PPI检测方法缺乏时空控制或“开/关开关”。这使得他们伟大的工具提供一个全球性的概述与诱饵蛋白潜在的扶少团团员,但另一面是很难知道哪些蛋白质与诱饵在一个特定的时间点,即当诱饵与特定的蛋白质交互合作伙伴或当诱饵是一个特定的蛋白质复合体的一部分。
- 不在本机单元上下文中执行。对于AP-MS，细胞在诱饵蛋白被拉下之前被裂解，通常使用抗体。这可以人为地针对在本机单元上下文之外不稳定的PPI进行选择。
Split-BioID方法
输入Split-BioID，一个时空可控的BioID协议版本。BioID和Split-BioID的关键组成部分是BirA*， BirA的混杂版本，an大肠杆菌生物素连接酶。在BioID中，BirA*与诱饵蛋白融合，并将诱饵半径~10 nm范围内的蛋白质生物素化。在split - bioid中，BirA*首先被分成两个非功能片段。当这两个片段靠近时，它们结合力量形成一种功能性的BirA*酶。这种实验被称为蛋白质片段互补试验(PCA)。
在Split-BioID方法中，每个BirA*片段然后融合到两个已知相互作用的诱饵蛋白中的一个。当这种相互作用发生时，BirA*活性恢复，附近的蛋白质被生物素标记。为了进行标记，BirA*融合蛋白通过质粒或稳定细胞系在细胞中表达，然后这些细胞在含生物素的培养基中生长。
烦恼是蛋白质片段互补分析的另一个例子，可用于研究二元蛋白质相互作用。然而，FRET通常只告诉你两种蛋白质是否相互作用，不能用来识别除了你已经荧光标记的相互作用伙伴。
图1:使用Split-BioID识别蛋白质蛋白质相互作用。Split BioID是一种蛋白质互补分析法，其中BirA*（一种大肠杆菌生物素连接酶）被拆分为两个非功能片段：N端BirA*（N-BirA*）和C端BiraA*（C-BirA*）。这两个片段融合到两个已知相互作用的蛋白质上，这里是蛋白质Y和Z。当蛋白质Y和Z相互作用时，两个BirA*片段相互补充，形成功能性BirA*酶。当这种相互作用发生时，BirA*活性被恢复，附近的蛋白质被生物素标记。当蛋白质Y和Z分开时，BirA*生物素化活性停止。
生物素标记BioID或分裂BioID中的蛋白质后，裂解细胞，提取蛋白质，并通过链霉亲和素下拉纯化标记的蛋白质相互作用物。胰蛋白酶消化后，通过质谱分析鉴定PPI。如果生物素化蛋白相对于对照组使用分裂类GFP进行富集，并且在六种不相关的蛋白质上运行类BioID，则它们被认为是可能的相互作用伙伴。
分裂生物的一个警告是BirA*融合的方向很重要！Schopp等人观察到融合蛋白表达和生物素化的不同水平，这取决于诱饵蛋白的哪一个末端被标记，以及诱饵蛋白的哪一个BirA*片段，即N-或C-末端被标记。最好测试所有组合，并选择通过westernblot测得的产生最强生物素化信号的条件，从而正确定位融合蛋白。
Split-BioID的优点
与其他PPI方法（包括BioID）相比，Split BioID的关键优势在于其相互作用蛋白质的时空受控标记；当两个诱饵蛋白质相互作用时，附近的蛋白质被生物素化，但当这两个诱饵蛋白质停止相互作用时，标记就停止了。这一特性对于动态蛋白质复合物的深入表征特别有用。
Split-BioID和BioID一样，也可以用于识别弱的和/或短暂的蛋白-蛋白相互作用，因为即使与BirA融合诱饵蛋白的相互作用停止，生物素标记仍然存在。最后，Split-BioID和BioID识别在原生细胞接触中与诱饵相互作用的蛋白质。其他PPI方法可能需要在细胞裂解和裂解液分离过程中蛋白质相互作用来保持稳定(或被稳定)。
Split-BioID的重要考虑
重要的是要记住，使用Split-BioID和BioID，任何在诱饵蛋白附近~10nm的蛋白质都将被生物素化。这使得不可能区分直接与诱饵相互作用的蛋白质和间接相互作用的蛋白质，或者仅仅是在诱饵蛋白质附近的蛋白质。SplitBioID提供了一个候选蛋白质列表，这些蛋白质是诱饵蛋白质相互作用的一部分，而不是确定特定的蛋白质-蛋白质相互作用。对这些候选蛋白的进一步鉴定对于理解它们如何与诱饵蛋白相互作用至关重要。
拆分类生物的另一个潜在限制是其标记速度。BioID需要6-24小时才能完成四环素诱导表达BirA*融合蛋白的表达和生物素化信号的饱和度。对于Split BioID，Schopp等人允许四环素诱导相互作用蛋白的表达和生物素化24小时。这种延长的潜伏期可能使检测半衰期短的蛋白质变得困难。
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参考文献
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- 这是Split BioID的不同版本。BirA*在与Schopp et al.不同的位置断裂。在这里找到这些分裂的仿生质粒！
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参考资料：Addgene.org
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