研究人员从质粒中表达感兴趣的基因，以研究基因功能或为特定目的设计细胞。不幸的是，质粒拷贝数在细胞群体内随时间而变化，导致可变的基因表达，从而影响观察到的表型。生长介质、生长温度和生长速率等因素都会影响细胞中的质粒拷贝数。
我们可以尝试以消除波动，由于引入的目的基因到染色体拷贝数。但是，这有其自身的问题。快速分裂的细胞引发基因组复制一次以上每细胞分裂，因此，基因更接近复制起点将被过表达的那些相比更远。
因此，可变的基因表达会使数据难以解释，或干扰代谢工程或其他合成生物学回路所需的精度。分子生物学家应该做什么？让我们来看看如何质粒最近由克里斯·福格特的实验室沉积无论拷贝数多少，都有助于保持基因表达稳定(西格尔-Shapiro等人，2018).
稳定促进剂的设计
T无论拷贝数多少，都要保持基因表达稳定，研究小组使用了稳定的启动子。与总是开启的不受调控的启动子相反，稳定的启动子包含反馈回路，如非相干前馈回路（iFFL）。一般来说，IFFL使用的输入信号对输出既有积极的控制，也有消极的控制。在这种情况下，质粒拷贝数是输入，基因表达是输出。
输入质粒拷贝数直接影响基因表达。就其本身而言，增加基因的拷贝数会增加其表达。然而，如果你通过使用对阻遏蛋白有反应的启动子来引入负调控，那么由于拷贝数的增加而导致的表达增加将得到控制。在这种iFFL中，随着质粒拷贝数的增加，阻遏蛋白的数量也增加，从而加强对感兴趣基因的阻遏并保持其表达水平恒定。
对于来自Segall Shapiro等人的稳定启动子，他们选择了故事蛋白作为阻遏因子，因为TALEs可以通过编程与任意DNA序列紧密结合，并且已被证明在细胞中实现约100倍的阻遏E.大肠杆菌.此外，故事结合非协作地与启动子区域，其被预测为需要解耦基因表达和质粒数量。
在从改性一套质粒pSC101与拷贝数范围为3-100每个单元，一个稳定化的启动子对缓冲的拷贝数上的报道基因表达的影响。在另一方面，使用相同的背景组成型启动子导致的基因表达的20倍的变化。
由于pSC101并不代表所有类型的质粒，因此也在大小不同或携带不同基因的不同质粒主干中测试了稳定启动子。在这些情况下，无论质粒拷贝数多少，基因表达也保持稳定。
稳定的基因表达是否缓慢或快速增长
生长培养基和成长期既可以影响基因拷贝数。此外，基因拷贝数是由不同的增长速度时，基因是从，而不是染色体中的质粒表达的影响。让我们来看看促销员稳定在这些类型变动的表现如何。
当细胞迅速分裂，多轮复制的发起细胞分裂了之前。这意味着，位于原点附近的基因将是超限额相比，那些渐行渐远。而组成型启动子驱使靠近复制的基因组起源最大的基因表达，所述启动子稳定创建由西格尔-Shapiro等人。近显示出基因表达没有依赖于位置的差异。
在另一方面，缓慢的增长也可引起质粒拷贝数变化。在从指数到固定相移，质粒的每个细胞的数量增加4-5倍（为的pUC质粒）或〜2倍（对于P15A，R6K和ColE2质粒）作为细胞分裂减慢（Kittleson等人，2011)Segall Shapiro等人表明，与组成型启动子相比，稳定的启动子能够更好地调节生长速率变化期间的基因表达。
在过渡到固定相，西格尔-Shapiro等人在模拟在质粒拷贝数的增加。放在反式短效惹巴蛋白在IPTG的控制下。因为RepA是质粒复制起始蛋白，他们可以通过改变IPTG浓度来改变质粒的拷贝数。IPTG浓度越高，RepA表达越高，质粒拷贝数越高。当他们增加IPTG浓度时，GFP上游的组成性启动子使GFP的表达增加了六倍，而稳定的启动子仅使表达增加了两倍。此外，使用稳定的启动子3小时后，基因表达水平恢复到基线水平，而组成启动子的基因表达没有恢复到基线水平。
质粒和染色体之间表达水平相似
该小组还发现，无论是基因从基因组或质粒中表达的基因表达的从稳定化的启动子的水平相等。因此，稳定化的启动子可允许系统从质粒到基因组中来移动，而不会大大地影响基因表达的水平。
例如，deoxychromoviridans的合成需要三个基因，它们的蛋白质依次需要的。当西格尔-Shapiro等人。放置在源基因的组成型启动子的控制下，然后转移到它们的基因组中，deoxychromoviridans生产滴度下降。但是，当基因被稳定化的启动子的控制下放置，deoxychromoviridans滴度相似不管其中所述基因表达。
有什么用稳定的基因表达的？
恒定的基因表达可以使从测定如定量PCR或微阵列中基因表达的读数更放心。但是，除了促进的p值<0.05的乐趣，具有基因表达的这样的精细控制是许多代谢工程和合成生物学目标是有用的。在代谢工程，酶的途径中的表达将理想地被优化，以促进产生所需的产物，同时避免有毒的中间体的累积或中间体的梭动到其他路径。在需要的产品的特定比率的情况下，如一个多蛋白复合物中，稳定化的启动子可消除不同组件之间的可变性。当您需要途径的基因表达水平的精确微调，给这些稳定促进一试。
参考
1.塞格尔·夏皮罗、托马斯·H·爱德华多·D·桑塔格和克里斯托弗·A·沃格特。“工程启动子使基因在细菌中以任意拷贝数持续表达。”自然生物技术36.4 (2018): 352. PubMedPMID:29553576.
2.Kittleson、Joshua T、Sherine Cheung和JChrither Anderson。“使用DIAL菌株快速优化大肠杆菌中的基因剂量。”杂志生物工程5.1 (2011): 10. PubMed
采购经理人指数：21787416. 公共医学中心PMCID:pmc316176.
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