不需要大羊驼-合成纳米体对抗膜蛋白

来自骆驼的纳米体很多媒体是治疗或预防COVID-19的一种有前途的方法。研究人员确定nanobodies结合冠状病毒刺突蛋白(Wrapp et al.， 2020)，这些蛋白位于冠状病毒表面，使病毒能够进入宿主细胞。为此，他们花了几天时间将来自两种不同冠状病毒的刺突蛋白注射到美洲驼中，并分离出特殊的骆驼抗体，这些抗体在细胞培养中与刺突蛋白结合，并抑制这些病毒。

但骆驼免疫也有其缺点：它需要骆驼类动物设施，常规获取这些设施的成本很高，而且当试图开发针对不稳定靶点的抗体时，如膜蛋白，这些靶点可能会因骆驼类动物的高体温（37.2-39.2°C）而展开，这一点尤其具有挑战性。Seeger实验室发现了一种方法，通过使用质粒生成sybody，合成纳米体对抗刺突蛋白(Walter et al.， 2020)。不需要骆驼。

合成纳米体的优点

纳米体是小的(12-15 kDa)单域蛋白质，可以有效地结合蛋白质目标，类似于抗体的作用。普通抗体的结构更重(约150kda)，呈y形，因为它包含两个大的重链和两个小的轻链，它们伸出来形成“手臂”，固定着与特定抗原结合的高度可变区域。相比之下，纳米体是一个单一的重结构域片段，来自一种称为重链抗体(HCab)的骆驼状抗体。由于它们的体积小，纳米体可以从细菌的质粒中合成表达，它们可以靶向抗体难以到达的抗原表位，比如隐藏在细胞表面分子缝隙蛋白质中的抗原表位。

图1:普通抗体、HCab和纳米体的比较。有关更多信息，请阅读我们的二级纳米体博客帖子．

一种快速选择平台生成针对膜蛋白的sybody

开发针对膜内蛋白质的抗体是很棘手的，因为它们的亲水表面较少，需要洗涤剂或脂质保持折叠，而且通常比其他蛋白质含量少。西格实验室开发了健壮的体外协议这使得合成纳米体(称为sybodies)能够在短短3周内针对膜蛋白目标进行快速选择(Zimmermann et al.， 2020)。该选择平台的设计使任何标准实验室都可以快速选择针对感兴趣的膜蛋白的联体使用Sybody代工具箱商业上可通过三个主要步骤获得试剂——所有这些都不需要找到骆驼养殖场!

为了找到一个最佳结合的sybody，你需要从大量不同的sybody开始，这些sybody假设包含与目标蛋白紧密结合的sybody。Seeger实验室设计了3种不同的mRNA sybody文库用于该方案，涵盖了3种自然产生的纳米体结构（凹面、环形和凸面）。这3个mRNA文库中的每一个都有一个凹面、环状或凸面支架，并在与抗原结合的区域随机分配一组不同的三核苷酸（对应于不同的氨基酸）。Seeger实验室可以直接以mRNA的形式为学术研究提供三个sybody库。

Sybody Generation Toolbox质粒工具包中也有用于生成自己库的模板质粒:SB_concave，SB_loop，SB_convex．这些支架在可能的位置含有丝氨酸和苏氨酸随机创建库(Zimmermann等人，2018年)。

找到Sybody Generation工具箱!

从文库和感兴趣的生物素化(用于纯化)蛋白靶点开始，该方案通过3个主要步骤来选择最佳的sybody候选体。

图2:针对膜蛋白选择sybody的过程概要。从图片Zimmermann等人，2018年．

核糖体展示

Seeger实验室开始使用核糖体显示的“预富集”选择步骤，因为它的优势是开始时初始库大小更大(高达10个)¹²成员)比较其他使用噬菌体和酵母的展示系统(10⁹－10¹⁰成员)。这个选择步骤涉及使用一个商用试剂盒进行mRNA文库的体外翻译。库中的每个mRNA分子不编码停止密码子，这导致核糖体在mRNA分子的末端暂停，形成一个由翻译的蛋白质(sybody)、核糖体和mRNA组成的核糖体复合体。在筛选过程中，与生物素化的靶蛋白结合的sybody可以被回收用于后续步骤。

噬菌体展示

从聚合体候选体富集池的mRNA被反向转录成cDNA片段，这些片段被有效地亚克隆到噬菌体中pDX_init质粒,使用片段交换(FX)克隆技术使用类型IIS限制网站(Geertsma, 2013)。一旦噬菌体被构建，它们被用来产生一个噬菌体库，由噬菌体组成，噬菌体在其外壳蛋白中显示候选联体，以筛选与目标蛋白的结合。该方案描述了通过两轮噬菌体展示来增加靶特异性sybody的富集。

酶联免疫吸附试验(ELISA)最终富集

从噬菌体展示屏幕富集的sybody池亚克隆(使用FX克隆)到表达载体pSb-Init，它将一个myc标签和一个his6标签连接到每个sybody候选体的末端。这些标签用于最后的富集步骤，以识别与感兴趣的蛋白质紧密而特异地结合的联体。西格实验室使用了上述的ELISA技术在他们的协议因为它不太容易识别非特异性和低亲和力的sybody (Zimmermann et al.， 2020)。该方案的这一步首先将抗myc抗体与ELISA板结合，以捕获myc标记的sybody。然后，加入生物素化的目标蛋白，经过几次洗涤后，使用比色反应检测结合。

酶联免疫吸附试验(ELISA)结束后，对筛选的sybody候选体(通常为10-30个)进行测序以进行鉴定。所有独特的sybody都可以亚克隆到pBXNPH3或pBXNPHM3用于生产无标签蛋白质的表达质粒，用于进一步表征和分析。

在对COVID-19大流行的快速反应中，西格实验室证明他们可以使用该协议快速识别和分离sybody在膜结合的刺突蛋白上发现SARS-CoV-2受体结合域，在显著的12个工作日内。虽然该实验室在COVID-19研究中使用了这种方法，但该协议为开发其他疾病的治疗方法或研究其他膜结合蛋白提供了希望。

可以找到这个sybody选择平台的完整协议在这里相关的质粒在Sybody生成工具箱．

找到西格实验室的SARS-CoV-2病毒!

工具书类

• Geertsma ER (2013) FX克隆:一种用于酶变体表征的通用高通量克隆系统。发表于:分子生物学中的方法。Humana出版社，第133-148页。https://doi.org/10.1007/978-1-62703-293-3_10
• Walter J等(2020)靶向SARS-CoV-2受体结合域的合成纳米体。BioRxiv。https://doi.org/10.1101/2020.04.16.045419．
• Wrapp D, De Vlieger D, Corbett KS, Torres GM, Wang N, Van Breedam W, Roose K, Van Schie L, Hoffmann M, Pöhlmann S, Graham BS, Callewaert N, Schepens B, Saelens X, McLellan JS(2020)单域Camelid抗体有效中和β冠状病毒的结构基础。细胞181:1004 - 1015。e15。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.031
• Zimmermann I, Egloff P, Hutter CAJ, Kuhn BT, Bräuer P, Newstead S, Dawson RJP, Geertsma ER, Seeger MA(2020)针对脆弱蛋白质的合成纳米体。自然协议15:1707 - 1741。https://doi.org/10.1038/s41596-020-0304-x
• Zimmermann I, Egloff P, Hutter CA, Arnold FM, Stohler P, Bocquet N, Hug MN, Huber S, Siegrist M, Hetemann L, Gera J, Gmür S, Spies P, Gygax D, Geertsma ER, Dawson RJ, Seeger MA(2018)合成膜蛋白构像捕获单域抗体。eLife 7:。https://doi.org/10.7554/elife.34317

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