视网膜细胞中细胞型特异性表达的合成启动子AAVs

腺相关病毒(AAV)是一种流行的基因传递工具，但它有一个缺点:如何确保你的基因到达你想要它去的地方?了解基因在特定细胞类型中的表达，不仅对基因治疗等转译研究很重要，而且对基础研究也很重要。为了提高AAV的细胞类型特异性，研究工作集中在修饰病毒的外部蛋白壳或衣壳，使其只进入并将其货物运送到特定的细胞类型。

罗斯卡的实验室巴塞尔分子和临床眼科研究所最近采取了一种不同的方法来增强视网膜细胞的特异性。要做到这一点，团队开发了一种寻找视网膜细胞类型特异性启动子的新策略．大多数现有的启动子在许多细胞类型中表达，如抑制性神经元、杆状细胞、锥状细胞或视网膜神经节。罗斯卡实验室不是使用自然产生的启动子来驱动转基因表达，而是从无开始构建合成的启动子，并测试它们是否驱动视网膜中特定类型的细胞表达。

设计合成促进剂的四种方法

为了建立一个合成促进子库，罗斯卡实验室使用了四种不同的设计策略:

• 策略# 1(快速三角帆船):用小鼠视网膜细胞类型特定基因的起始密码子上游序列创建启动子。
• 策略# 2(概率):使用至少两个高表达和高细胞型特异性基因转录起始位点上游的系统进化保守序列创建启动子。
• 策略# 3 (ProC):通过重复带有随机序列的小鼠细胞类型特异性转录因子结合位点来创建启动子。
• 策略# 4(刺激):在……的帮助下创建推广者表观遗传分析并利用老鼠视网膜细胞中转录活性的DNA片段进行设计。

图1:用于设计合成启动子的四种策略。图示:TSS:转录起始位点。TFBS:转录因子结合位点。从图片Jüttner等人，2019年获得许可．

总的来说，这个文库包含226个AAVs，每个AAVs都有一个不同的合成启动子驱动同一个转基因的表达:一个光遗传报告基因，通道rhodopsin，融合到一个荧光GFP标记(CatCH-GFP)。实验室的沉积含有Addgene活性启动子的AAV质粒．

合成启动子AAVs在小鼠中的性能

所有这些合成的启动子AAVs首先被注射到小鼠的眼睛中，以检测GFP的细胞类型特异性表达。一半(113)在注射后4周在视网膜细胞中表达，14%在特定的细胞类型(如杆状细胞或锥状细胞)或细胞类别(如:包括杆状细胞和锥状细胞的光感受器)中有靶向表达。

目标表达定义为至少满足以下条件之一:

• 超过90%的表达发生在一种细胞中
• 超过50%的表达发生在一种类型的细胞中，其余的表达仅发生在Müller胶质细胞中，这是AAV靶向的常见污染
• 70%以上的表达来自单一类细胞

在四种不同的启动子设计中，策略#4的启动子具有最高的靶向表达率。令人惊讶的是，不到1%的合成启动子复制了它们来源的野生型启动子的表达特异性。合成启动子,然而,倾向于松散匹配源基因的特异性,即如果一个合成启动子表达在细胞外视网膜的一部分,它更可能借来的元素从一个自然的启动子是活跃在外层视网膜的一部分。

找到AAV合成启动子质粒!

比较合成启动子在小鼠、猴子和人类视网膜上的表现

接下来，在老鼠视网膜中活跃的113个AAV启动子被注射到猕猴和死后的人类视网膜中。大约25%的AAV合成启动子成功地靶向猴子和人类视网膜中的细胞。通过比较这三个物种中启动子的表现，罗斯卡实验室得出结论，启动子在小鼠中针对细胞类的能力并不能很好地预测在NHPs (R=0.38)和人类(R=0.32)中针对同一细胞类的能力，但是，启动子在所有三种物种中针对同一类细胞的几率仍然大于随机几率。启动子在灵长类和人类视网膜中表达而在小鼠中不表达的几率很低(R=0.12)，这表明小鼠可以用来消除在灵长类和人类中也不太可能表达的启动子。另一方面，AAV靶向猴子细胞类的能力是一个很好的预测指标，它可以靶向人类相同的细胞类(R=0.67)。

可以找到所有可重复标记视网膜细胞的aav的显微镜图像数据库在这里．

合成促进剂aav的应用

除了限制AAV转基因表达到特定的细胞类型或类外，这些合成启动子还有其他一些潜在的应用:

1. 使用启动子组合进行目标表达:虽然很少有合成启动子针对特定的细胞类型，但是一对对合成启动子可以根据两个启动子表达的细胞类型的重叠来限制单个细胞类型的表达。实验室用一个启动子驱动crec - mcherry表达，用第二个启动子驱动crec依赖的荧光CatCH-GFP报告基因表达。GFP的表达只会在creu - mcherry也表达的细胞中产生。如果creu - mcherry在光感受器和水平细胞中表达，creu -dependent-GFP在水平细胞和神经节细胞中表达，那么只有两种aav转导的水平细胞才会表达creu - mcherry和GFP。
   

   图2:合成启动子可以配对进行靶向表达。

   
   这种合成启动子的配对也被用于靶向多种细胞类型，也可以用于神经元的稀疏标记，用于跟踪实验。
   
   
2. 神经跟踪实验：虽然高标记率的合成启动子是基因治疗应用的理想选择，但产生稀疏标记的启动子将有助于神经元追踪实验，因为较低的标记水平使追踪神经元的投射更容易。
   
   
3. 生成动物模型:转基因动物允许基因在特定组织中表达，但它们的产生成本高，耗时长，特别是对于大型动物，如灵长类动物。188完整比分直播在动物模型中，带有细胞型特异性启动子的病毒载体可能是一种更容易限制基因表达的方法。

合成AAV启动子工具包

罗斯卡实验室的合成启动子AAVs允许在小鼠、灵长类和人类视网膜的视网膜细胞类型和类别中靶向基因表达。这些合成的启动子在基因治疗的基础和转译研究中都是有价值的工具。罗斯卡实验室希望如此设计改进的版本，他们目前的推广，以及更多针对当前文库缺失细胞类型的启动子(Neff et al.， 2019)。在视网膜细胞中进行测试时，同样的设计原则可以用于在其他组织中创造细胞类型靶向表达的合成启动子。

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参考文献

Juettner, J.， Szabó， A.， Gross-Scherf, B.， Morikawa, r.k.， Rompani, s.b.， Hantz, P.， Szikra, T.， Esposti, F.， Cowan, c.s.， Bharioke, A.， Patino-Alvarez, c.p.， Keleş， Ö。库斯尼里克，A.，阿祖莱，T.，哈特尔，D.，克雷布斯，A.， Schübeler, D.， Hajdú，罗德岛，Lukáts， Á。，Németh, J., Nagy, Z.Z., Wu, K., Wu, R., Xiang, L., Fang, X., Jin, Z., Goldblum, D., Hasler, P.W., Scholl, H.P., Krol, J., & Roska, B. (2019). Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience, 22, 1345-1356.https://doi.org/10.1038/s41593-019-0431-2

小鼠、猕猴和人类视网膜细胞表达的AAV文库。实验室动物264(2019)。https://doi.org/10.1038/s41684-019-0380-0