轻松标记您最喜欢的酵母基因

同源重组是几乎所有生命领域修复基因组损伤，特别是双链断裂的过程。研究人员长期以来一直利用这一自然过程将蛋白质标签整合到基因组中酿酒酵母和S. Pombe.．该方案令人惊讶的是简单，只需要含有含有大约50个碱基对插入的染色体位点的修饰序列的PCR产物。通过直接转化将线性PCR产物引入细胞中。给定的插入件通常含有蛋白质修饰序列和可选择基因产物，用于分离成功的转化体。

Addgene分布几个现成的、模块化的质粒，结合荧光标记、表位标记、蛋白酶位点和选择标记。这在需要标记多个蛋白质产品的蛋白质复合物研究中特别有用，因为多个选择标记可以确保所有所需的标记都已集成。简单地设计你的扩增引物与期望的目标同源性-在框架内，当然-并开始标记!

酵母优化的成像荧光团

李志强，李志刚，等。(2013)PLoS ONE 8(7): e67902。

许多成像研究依赖于直接融合荧光蛋白金宝搏app下载（FPS）对感兴趣的酵母基因。这些荧光标记的基因在天然条件下表达，并且允许科学家不仅追踪各个蛋白质的丰度，运动和定位，而且还通过褶皱来研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。Sidae Lee，Wendell Lim.， 和Kurt Thorn.加州大学旧金山分校的研究人员最近开发了一系列蓝色、绿色和红色的FPs，它们是专为酵母表达而优化的密码子。这些标记载体基于前面描述的pFA6a-link载体，包括Kan、SpHIS5或CaURA3选择标记。Lee等人。（1）评估了很多荧光标签酿酒酵母，观察它们在亮度、稳定性和被标记蛋白质的破坏等方面的表现。基于他们的发现，作者推荐了在酵母成像中使用的最佳FP组合，根据特定的过滤集和实验输出要求进行分类。选择从这些酵母优化荧光团标记矢量用于您的单色或多色成像实验。

如果你正在寻找关于成像技术的资源，请查看Kurt刺的显微镜博客．

对抗原决定基标签感兴趣?

其他人可能会感兴趣附加表位标记对他们的感兴趣的基因，允许容易地捕获和检测蛋白质和复合物，而没有有时与基于质粒的过表达相关的伪影。Tim Formosa.，在犹他大学，建立了完整的酵母标记模块的收集使用蛋白酶位点(TEV或PreScission)、表位标签(12xHis、2xStrep、3xFlag、Protein A或V5)和选择标记(KanMX、HphMX或His3MX)。从该收集的每个PCR产物将产生一个格式为(蛋白酶位点)- 6xgly连接子-(表位标签)- adh1终止子-(选择标记)的插入片段。此外，Formosa博士已经沉积了6个质粒与多个克隆位点，以取代表位标签，以创建您自己独特的蛋白质融合。这个系列是理想的串联亲和纯化的蛋白质复合物。

约翰•普林格尔和JürgBähler.在北卡罗来纳大学教堂山分校普林格尔博士以前的实验室开发的酵母中储存了大量用于基因组修改的质粒。bähler等。（2）描述一个模块集合质粒用于广泛的基因组修改美国非洲酒，包括全部和部分基因删除，超表达(由启动子取代)，和标签在N-或C-末端（3xHa，13xMyc，GST或GFP）。Longtine et al。(3)描述一套免费赠送的用于使用的质粒酿酒酵母，还有一个额外的好处是在单一品系中结合多种选择标记进行修饰。

除了上述的收集，许多其他模块化酵母标记系统已经开发的实验室安妮·罗宾逊，Eishi野口勇， 和梅丽莎·摩尔，等等。

您是否在您自己的实验室中使用过这些工具？Addgene很乐意听到您，我们的社区，关于酵母基因组修改的经验。基因组标记系统在哪些方面使您能够推进您的研究?你是否有一个最喜欢的没有在这里提到的标签系统?

参考：

1. 李S，林华，索恩。《公共科学图书馆•综合》．2013年7月2;8 (7):e67902。
2. Bähler J, Wu JQ, Longtine MS, Shah NG, McKenzie A 3rd, Steever AB, Wach A, Philippsen P, Pringle JR。酵母．1998年7月,14日(10):943 - 51。
3. Longtine MS, McKenzie A 3rd, Demarini DJ, Shah NG, Wach A, Brachat A, Philippsen P, Pringle JR。酵母．1998年7月,14日(10):953 - 61．