本文作者是埃默里大学医学院副教授阿德里亚娜·加尔文。
光遗传学和化学遗传学是调节神经元和其他脑细胞活动的有力工具。由于这些技术中使用的视蛋白或化学受体不能用荧光或免疫组织化学方法直接显示，因此这些蛋白质通常融合到细胞中'标签'或'标签'蛋白质以便于检测。
金宝搏app下载荧光蛋白是应用最广泛的标签，因为它们发出内源性荧光，在适当的荧光照明下易于检测活体内，离体，或尸检实验。荧光蛋白也可以通过抗体和免疫组织化学技术进行鉴金宝搏app下载定。因此，这些蛋白质为鉴定感兴趣的转基因表达提供了一种通用的方法。此外，荧光团变体（例如绿色和红色荧光蛋白）允许同时识别多个感兴趣的蛋白质。
然而，根据我们的经验，我们发现荧光蛋白可能并不总是最好的选择。金宝搏app下载
金宝搏app下载荧光蛋白可以干扰融合蛋白的功能
在某些情况下，融合的荧光蛋白可能是感兴趣蛋白表达的障碍而不是帮助。金宝搏app下载绿色荧光蛋白(GFP)和mCherry是目前最常用的两种标签，大约有240个氨基酸。这些蛋白质的大小，或它们之间的二聚作用，可能会影响融合蛋白的性质或运输（Kimple等人，2013年）。
我们发现荧光蛋白确实可以干扰相关蛋白金宝搏app下载的正确功能。在我们的研究中，我们使用AAV病毒载体188完整比分直播快速hM4Di在神经元中恒河猴或小鼠（Galvan等人，2019年）。这个hM4Di受体是一个工程G我蛋白质偶联受体，其中之一由设计药物专门激活的设计受体（D）（Armburster等人，2007年）。
我们最初使用hM4Di与mCherry融合的结构。为了研究hM4Di的定位，我们使用了针对McHery的一级抗体和耦合到纳米金颗粒的二级抗体，这使得蛋白质定位具有较高的空间分辨率。令人惊讶的是，我们在电子显微镜下的观察结果表明，在猴子神经元中，大部分金颗粒位于树突的细胞质中，只有一小部分位于质膜上（图1中的上图）。当然，这是有问题的，因为恐惧受体需要位于质膜上，在给药后被恐惧促动器激活。虽然我们在小鼠神经元的细胞膜上发现了更大的比例，但大多数仍然是细胞质。
使用“小”标签来识别蛋白质
鉴于hM4Di-mCherry在猴神经元质膜上的表达有限，我们接下来假设与hM4Di融合的不同标签可能会改善这种恐惧向质膜的转运。这个血凝素（HA）标签是流感病毒血凝素的一个小的9个氨基酸表位，30多年前被引入融合蛋白领域(field et al.， 1988)。因此，我们在小鼠和猴子的大脑中注射了携带hM4Di-HA的aav。令人惊讶的是，我们发现这个小小的改变带来了很大的不同。用HA标签替换mCherry后，两种物种的质膜中都有大量的hM4Di表达(图1底部)。
我们的结果表明，标签蛋白可能对感兴趣转基因的表达及其在膜上的定位有重要的影响。我们从这些研究中得到的教训是，标签蛋白可以影响感兴趣的转基因的表达。在我们的研究中，mCherry干扰了dreadd向膜的运输。在不需要荧光的研究中，使用HA和其他短表位标签(Kimple et al.， 2013)可以帮助改善感兴趣的蛋白质在膜上的运输。
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图1:电子显微镜图像显示hM4Di在猴子体内的超微结构定位。应用预包埋免疫金技术揭示与mCherry(上)或HA标签(下)偶联的hM4Di。这些图像显示了猴子杏仁核中的树突(蓝色阴影)。红色和绿色箭头分别指向位于细胞质或结合在质膜上的金颗粒。注意，HA标签的使用显著改善了hM4Di到质膜的运输。 |
我们的研究证明，在某些情况下，某些荧光蛋白可能对感兴趣的蛋白的表达有害。然而，我金宝搏app下载们也发现，这并不是所有融合蛋白都可以概括的。例如，我们发现另一种类型的恐惧，hM3Dq，即使与McHery融合，也能在质膜上成功表达。但我们的数据确实强调了仔细描述转基因表达的重要性。
我应该使用哪个标签？
在确定合适的标签时，应以实验设计为主要指导。我们的研究结果表明，当荧光不是识别视蛋白或化学发生受体表达的必要条件时，非荧光标记可能比荧光蛋白更有利。金宝搏app下载然而，在某些情况下，荧光信号可能是至关重要的实验。由于融合蛋白可能会阻碍感兴趣蛋白的成功表达，另一种选择可能是通过视蛋白或化学发生受体的双反子表达荧光蛋白IRES或2A序列．在这种情况下，蛋白质没有融合。标签蛋白将在同一细胞中表达，但不一定在视蛋白或化学发生受体相同的亚细胞室中表达。在许多研究中，这可能不是一个重要的限制，甚至在某些类型的实验中可能是有益的(例如，当神经pil中表达的荧光掩盖了对视蛋白表达细胞的识别)。
要了解荧光蛋白融合时需要记住的其他事项，请查看Addgene博客上Joachim Goedhart的文章：188博金宝官网金宝搏app下载荧光蛋白101：绿色荧光蛋白融合蛋白-建立正确的连接．
感谢我们的客座博主！
阿德里亚娜·加尔文(Adriana Galvan)是埃默里大学医学院的副教授，也是耶基斯国家灵长类动物研究中心的研究员。结合使用体内在解剖学技术方面，她的研究旨在对运动障碍的基底神经节的生理学和病理学有更深入的了解。
参考资料和资源
工具书类
Armbruster BN，Li X，Pausch MH，Herlitze S，Roth BL（2007）进化锁以适应钥匙，从而创建一个由惰性配体潜在激活的G蛋白偶联受体家族。美国国家科学院院刊104:5163–5168。https://doi.org/10.1073/pnas.0700293104
Field J, Nikawa J, Broek D, MacDonald B, Rodgers L, Wilson IA, Lerner RA, Wigler M(1988)纯化ras响应型腺苷酸环化酶复合物酿酒酵母通过使用表位添加方法。摩尔细胞生物学8:2159–2165。https://doi.org/10.1128/mcb.8.5.2159
GalvaA，Raper J，Hu X，Palayj，Bonaventura J，Richie CT，Michaelides M，Mueller SAL，Roseboom PH，Calin NH，Y，Y（2019）猴DeldD的超微结构定位。欧洲神经科学杂志50:2801–2813。https://doi.org/10.1111/ejn.14429
Kimple ME，Brill AL，Pasker RL（2013）蛋白质纯化亲和标签概述。蛋白质科学的当前协议73:。https://doi.org/10.1002/0471140864.ps0909s73
其他参考资料在Addgene博客188博金宝官网
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