目前全世界有2500多万人感染慢病毒hiv - 1。今天，HIV-1病毒可以通过抗病毒疗法加以控制，使其在血液中无法检测到。但病毒并没有完全消失;它只是隐藏在潜伏的感染细胞中。要真正治愈HIV-1，研究人员需要消除这些隐藏的病毒宿主，CRISPR可能是完成这项艰巨工作的途径!卡迈勒哈利利的实验室坦普尔大学的研究人员展示了CRISPR-HIV治疗的两种潜在策略——一种是使用dCas9-SAM激活HIV-1转录并破坏受感染细胞，另一种使用野生型Cas9从受感染细胞中移除HIV-1基因组。继续读下去，了解CRISPR如何在体外治疗HIV-1，以及临床成功必须克服哪些障碍。
ART和HIV-1的宿主
HIV-1感染免疫系统中的细胞，特别是CD4+ t细胞，并最终导致未经治疗的个体获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。艾滋病的症状包括体重迅速减轻和感染风险增加，包括普通感染和健康个体中不常见的机会感染。抗逆转录病毒疗法(ART)实际上可以消除血浆HIV-1，提高HIV-1患者的预期寿命和质量。然而，抗逆转录病毒疗法并不能治愈HIV-1。在停止抗逆转录病毒治疗的患者中，由于潜伏在受感染细胞中的病毒宿主，病毒水平将很快飙升回治疗前的水平。尽管接受art治疗的患者血浆中缺乏HIV-1，但他们患其他慢性病的风险增加，包括痴呆、肠道疾病、神经损伤和心脏病。这增加了患病的风险由于潜在的HIV宿主、慢性炎症和ART的负代谢影响。
为什么身体不能产生免疫反应来摧毁这些宿主呢?从本质上说，免疫系统看不到任何它应该做出反应的威胁。潜伏感染的细胞逃避免疫检测，因为它们产生的病毒蛋白很少或根本不产生。为了解决这一问题，提出了两种策略。
第一种是“休克和杀死”，目的是重新激活潜伏的艾滋病毒，使受感染的细胞产生病毒蛋白并通过细胞毒性或免疫反应死亡。第二种策略是简单地从受感染的细胞中去除HIV-1基因组，随着CRISPR的出现，这个想法变得更加现实。
使用CRISPR/Cas9 SAM“休克和杀死”
为了“休克并杀死”hiv感染的宿主，研究人员以前已经使用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂来增加整合的HIV-1基因组的转录。对于有针对性的方法，Zhang et al。转向CRISPR/Cas9协同激活介质(SAM)系统可从Addgene。该系统使用通常用于激活转录的dCas9-VP64融合，但有两个额外的激活域(MS2和p65)来增强转录激活。
Zhang等人设计了多个gRNAs来靶向作为启动子的HIV-1基因组的5’长末端重复序列(LTR)，并发现SAM靶向NF-KB结合位点附近的增强子区域会增加HIV启动子荧光素酶结构的激活。在多个潜伏的HIV-1 T细胞系和一个潜伏的小胶质细胞系中，CRISPR/Cas9 SAM治疗增加了激活的HIV-1细胞的百分比，通过HIV-1启动子驱动的GFP表达来测量。在能够产生HIV-1毒性蛋白的细胞系中，CRISPR/Cas9 SAM引起细胞凋亡，表明真正的“休克和杀伤”反应。
用CRISPR/Cas9将HIV-1从基因组中分离出来
在引入CRISPR之前，用ZFNs和TALENs进行的HIV-1基因组编辑主要集中在破坏CCR5，这是HIV-1用来进入细胞的受体。ZFNs和CRISPR/Cas9也被用于制造对HIV-1复制至关重要的基因突变。然而，这种方法可以产生一些病毒蛋白质，因此研究人员也对从受感染细胞中精确切除HIV-1基因组感兴趣。ZFNs被用于概念验证研究，但研究人员认为，使用CRISPR/Cas9可以提高效率，降低脱靶效应的概率。
在这种治疗中，CRISPR/Cas9需要1。从每个被感染的细胞中切除HIV-1的基因组2。防止这些细胞再次感染。卡明斯基等。设计了靶向HIV-1 5’和3’ltr的gRNAs，并在t细胞系2D10中与Cas9一起表达。聚合样本的PCR扩增和Sanger测序显示，大部分HIV-1基因组已被切除，只留下一小部分ltr连接在一起。克隆Cas9/ grna表达的细胞群也对HIV-1再感染免疫。
重要的是，没有检测到脱靶效应。Kaminski等人观察到Cas9/gRNA表达对细胞活力、细胞周期进展或凋亡没有负面影响。一项合并分析发现，在预测的与gRNA靶序列不匹配的多达7个脱靶位点上，没有发现Cas9裂解的证据。
Kaminski等人接下来在HIV-1感染的t细胞上测试了他们的程序，看它们是否能被CRISPR拯救。从健康个体中分离出CD4+ t细胞，扩增并感染HIV-1。对于两株HIV-1菌株，Cas9/gRNA慢病毒表达显著降低了HIV-1拷贝数，尽管菌株之间的效率在48-100%之间存在差异。在一个类似的实验中，CRISPR将来自两名HIV-1感染患者的分离CD4+ t细胞中的HIV-1拷贝数减少了50%以上。尽管这是一个令人兴奋的发现，但需要注意的是，这些HIV-1患者是art naive，所以这个实验模拟的是活跃的HIV-1感染期，而不是大多数HIV-1患者中发现的art诱导病毒控制期。
CRISPR HIV-1治疗的障碍
这两种方法都代表了临床前HIV-1研究的令人兴奋的进展，应该在动物模型上进行，很难判断是否有一种方法可能更成功。“休克和杀伤”的优点是杀死感染了HIV-1的细胞，耗尽病毒库，而且这种方法不需要功能性Cas9核酸酶，因此不存在异常DNA切割的可能性。HIV-1直接切割允许t细胞存活，但防止再次感染需要持续表达Cas9/gRNAs，这可能导致更高的脱靶切割率。
在这两种情况下，将体外实验转化为动物模型都面临两个关键障碍。第一个是将CRISPR机制传递到所有的靶细胞。鉴于病毒库跨越多个器官系统，这一目标可能特别困难。这两种方法可能在感染过程的早期更成功，当HIV-1局限于t细胞的子集时，但尚不清楚是否能找到足够的t细胞来消融一个成熟的病毒宿主。
CRISPR HIV-1疗法的第二个挑战是序列特异性。虽然抗病毒疗法在蛋白质结构水平上靶向HIV-1，但CRISPR grna需要DNA序列特异性结合。需要对患者的HIV-1基因组进行测序，以确定“休克和杀伤”或病毒切除方法的最佳gRNAs，并且需要验证每一种gRNAs是否具有高靶上结合和低靶外结合。HIV-1也有可能通过PAM或种子序列突变进化出对CRISPR疗法的耐药性。多种gRNAs可以用来解决这个问题，就像抗逆转录病毒疗法包括多种药物来降低产生耐药性的几率一样。
在Kaminski等人发表了他们的研究结果后不久，Wang等人发现HIV-1可以从CRISPR/ cas9诱导的靶向ltr或基本基因的修饰中逃脱。其中许多逃逸突变位于Cas9剪切位点附近，这使得Wang等人得出结论，一些Cas9衍生的插入位点可能不会消融病毒功能，而是促进了对CRISPR/Cas9的耐药性。虽然这些结果令人沮丧，但值得注意的是，这些实验是在细胞培养中进行的，并且只有在Cas9/gRNA稳定表达后感染了HIV-1细胞。在这个模型中，病毒的产生比潜伏的HIV-1感染要高，这将使“逃逸”病毒更容易繁殖和感染邻近的细胞。确定CRISPR/Cas9是否发生在动物模型中是很重要的。如果这些逃逸突变频繁发生，dcas9介导的“休克和杀死”策略可能是比直接切割更好的选择。
尽管将这些发现转化为一种疗法存在潜在的困难，但这些论文提供了诱人的证据，表明我们可能就能治愈HIV-1。类似的研究表明，CRISPR可以用来对抗其他病毒感染，尤其是老鼠模型Hepatitis B这种疾病感染了全世界超过2.5亿人。正如我们之前在CRISPR领域所看到的，在追求一种技术应用的过程中所学到的经验可以使许多其他应用受益，并加快研究的步伐。我们Addgene希望在接下来的几年里，体内CRISPR传递的问题变得更容易处理，因为它将为一些世界上最常见的疾病打开许多新的治疗可能性。
参考文献
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- 找到山姆质粒在Addgene的这篇出版物中使用。
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