这篇文章是由客座博主Jessica Sacher撰写的，她是阿尔伯塔大学的微生物学博士，在Szymanski实验室学习。
研究噬菌体如何识别宿主的原因
噬菌体(以细菌为食的病毒)可能是地球上数量最多、种类最多的生物实体，但我们对它们如何感染和影响它们的细菌猎物的进化仍然知之甚少。目前，噬菌体的宿主识别因子受体结合蛋白(receptor binding proteins, RBPs)是噬菌体蛋白研究的热点之一。这些是非常有用的生物技术产业该公司正在利用噬菌体rbp作为诊断工具和治疗手段。此外，全噬菌体作为治疗手段的策略使用，最近也获得了许多新的吸引力(1，2，取决于噬菌体在宿主细胞上识别的结构。
更有趣的是，当噬菌体接近宿主细胞表面时，它所面对的大部分是复杂的多糖结构，其中许多很容易被细胞改变，其结构刚刚开始被理解。因此，除了它们在卫生部门的用途外，噬菌体是碳水化合物结合蛋白的蓄水池，等待着被探索和开发。有了更好的表征，这些蛋白质可以作为替代抗体，在分子生物学实验室中识别和表征糖和含糖分子(参见综述)辛普森等人，2015年）.
问题是:宿主结合蛋白很难找到
测序和克隆噬菌体的DNA可能比较困难，部分原因是噬菌体经常通过添加甲基、糖基和其他碱基来改变它们的DNA，以保护它们的DNA免受宿主细胞核酸酶(4）.更复杂的是，即使进行了测序，噬菌体基因组也往往充满了开放的阅读框，与其他任何东西几乎没有同源性，这使得快速识别可能的基因功能变得困难。在这篇文章中，我将描述我们的实验室(Szymanski实验室，它最近从加拿大埃德蒙顿的阿尔伯塔大学搬到了佐治亚大学，(美国)已经开发出一种噬菌体基因组，可以在不需要基因组测序或注释的情况下探测具有宿主结合活性的蛋白质(5）.在基因组测序成功的情况下，这项技术还可以帮助确定已测序基因组中的基因，这些基因为功能细胞结合蛋白编码，在(太常见了)基于同源性的搜索没有返回候选基因的情况下。
我们的策略:表达噬菌体基因组的随机片段和活细胞探针
下面是对由辛普森、萨赫和西曼斯基2016年1月在《病毒》中的表现(5)．有关该分析方法的更多细节，包括使用该方法成功识别rbp的例子，请参阅本文。
步骤1:制备噬菌体DNA随机片段库
第一步包括将噬菌体基因组DNA消化成1- 3kb(大约基因大小)片段，以便克隆到这些片段大肠杆菌以及随后筛选的具有细胞结合能力的蛋白质(6）.
这可以通过使用具有短识别序列的限制性内切酶(如MluCI)来实现，这种酶将足够频繁地切割DNA，从而产生碎片涂片，随着消化时间的延长，碎片的大小会变小。然而，对于难以酶解的噬菌体DNA，物理碎片策略是可取的。雾化包括使用压缩氮气迫使DNA通过一个小开口;这将在随机的位置剪切DNA，并允许通过控制雾化时间和压力来选择给定的片段大小。雾化装置是一种小型塑料容器，可以很容易地通过软管连接到带有压力调节器的氮气罐上，购买成本较低。其他的物理剪切方法也存在，如超声波和针式剪切。从本质上说，任何导致大量的结果片段落在1到3 kb之间的方法都能获得捕获整个RBP基因的最佳可能性，而不会导致克隆大片段相关的问题。
断裂后，用T4 DNA聚合酶修复被剪断的端部(使端部变钝)连接成一个直接消化的载体专为蛋白质的过度表达大肠杆菌,如pET30a．如果使用的DNA不易被酶操作，在片段化之前用phi29聚合酶扩增噬菌体DNA可以极大地促进下游操作。Phi29聚合酶是一种源自噬菌体的聚合酶，即使在DNA碱基发生某些修饰的情况下，也能进行全基因组扩增(通过一种称为多重置换扩增的机制)。
结扎和转换生成的质粒库化学主管大肠杆菌并分析适当尺寸的刀片的变压器。我们认为一个图书馆值得使用，如果至少40%的菌落测试显示正确大小插入如下菌落PCR使用引物接近载体的多个克隆位点的10-20个菌落。为了减少某些克隆在液体培养中被其他克隆赶超的机会，稀释和皿化单个菌落的完整转化子库(这通常需要10-20个皿)(见下表)。这个初始转换应该使用一个可以用于长期库存储的高度胜任的菌株来执行。经过一夜的生长，从菌落中收集、收集和直接提取质粒DNA。将产生的质粒DNA转化成大肠杆菌BL21 (DE3)细胞(这些细胞的T7聚合酶和一些蛋白酶被敲除，使它们对蛋白质生产特别有用)，然后稀释和平板转化物，在20个新鲜的选择板上分离菌落(每个平板150-200个)。
第二步:随机表达噬菌体DNA片段大肠杆菌
既然随机的DNA片段已经被克隆到大肠杆菌细胞，分离的菌落将被提升到硝化纤维素膜上，并暴露于IPTG，以诱导蛋白表达。然后，细胞膜上的细胞将暴露在裂解缓冲液中，将重组蛋白直接释放到硝基纤维素上，以便后续探测细胞结合活性。
首先，切下20个培养皿大小的硝化纤维素膜圈，轻轻压在菌落盘上。在继续前进之前，先在底片上标出每一层膜的方向。然后每个膜剥掉板(保存板可以再生了殖民地在一夜之间),膜,并将其翻转colony-side到新鲜磅板包含一个适当的诱导代理人(0.4毫米IPTG是一个好的开始,如果你使用一个宠物向量)抗生素质粒的选择。用钳子将膜与琼脂之间的气泡清除。可能需要测试几种蛋白质诱导条件，如任何蛋白质纯化，但在30°C过夜是一个良好的开始。
准备一份含有你最喜欢的细菌蛋白提取试剂的裂解液(英国石油公司从热工作良好)与一些添加溶菌酶，dna酶I，蛋白酶抑制剂鸡尾酒。在20个空培养皿底部铺上厚滤纸，用裂解液(每个约3ml)浸透每个培养皿，倒出多余的培养皿。
当蛋白质诱导完成后，将膜从培养皿上剥离，并将每一层膜放在溶解液浸泡过的滤纸上(菌落面朝上)，在室温下静置1小时。在这之后，对你的细胞膜进行数次冻融循环以促进细胞裂解是有帮助的:在-20°C(或-80°C) 5分钟和37°C 5分钟之间交替(每重复5次)效果很好。在这些步骤中，将薄膜在冰箱中过夜也是一个方便的停止(即。回家和吃饭和睡觉)点为这个实验。
步骤3:用活的宿主细胞随机探测噬菌体DNA片段
现在你可以继续用你感兴趣的细胞孵育这层膜并让它们在一夜之间生长。假设它们表达良好，文库中的质粒编码的蛋白质将继续附着在其宿主菌落生长的相同位置的细胞膜上。如果你感兴趣的细胞与给定的蛋白质粘在同一个位置，你就有了一个潜在的受体结合蛋白，可以回到最初的平板，以确定是哪个噬菌体基因编码了该蛋白质!
首先，用牛血清白蛋白或脱脂牛奶阻断细胞膜，就像进行Western blot一样，以减少非特异性结合细胞膜本身或库中表达的任何“黏性”蛋白的细胞数量。在室温下轻轻摇一摇，封闭1小时后，轻轻地从每一层膜上吸去多余的液体，并将新鲜的Kimwipe片牢牢地压在每一层膜上，以清除细胞碎片。然后，用紫外线照射细胞膜15分钟，杀死任何剩余的活细胞大肠杆菌。在这一点上，为了增强重组蛋白的折叠，将膜在500 mM到1 M NaCl中孵育过夜确实有帮助。每种蛋白质的最佳盐浓度不同，但我们研究过的一些噬菌体rbp倾向于在高盐存在时更有效地结合细胞。
用目标细菌细胞探测细胞膜，然后用PBST清洗膜以除去盐将新鲜收获的细胞(最好是对数期)悬浮在阻断溶液中(大约108CFU/mL是一个很好的开始)，将膜加入溶液中，在室温下轻轻摇晃1小时。这将允许任何在细胞膜上表达的rbp结合它们的靶细胞，将它们从溶液中拉出来。用PBST清洗膜的细胞。
要检测结合的细胞，只需将每一层膜选择性地放置在目标生物的琼脂平板上，并根据适当的细胞生长条件孵育过夜。注意:如使用快速生长的细菌大肠杆菌或沙门氏菌，或任何与硝化纤维素结合强烈的细胞，培养皿的过度孵育可能导致高背景，使所需的信号模糊。我们已经成功地纠正了这个问题，在室温下培养约8-12小时，而不是在最佳生长温度下过夜。如果你足够幸运有一个抗体或其他蛋白质特别是绑定你的目标生物的手上,它可以帮助发现这种蛋白质直接硝基和落实步骤屏蔽膜与细胞为了探索优化这部分分析之前用一个随机的图书馆。
在孵育之后，你应该可以看到菌落在膜上生长大肠杆菌最初定位了表达功能性结合蛋白的菌落。现在你可以培养你感兴趣的菌落，对插入的DNA进行测序，并确定新的假定的宿主细胞结合蛋白的特征!
非常感谢我们的客座博主Jessica Sacher!
杰西卡·萨彻(Jessica Sacher)是阿尔伯塔大学(University of Alberta) Szymanski实验室的一名微生物学博士(尽管她在该实验室最近搬到佐治亚大学(University of Georgia)期间被附属于该实验室)。她喜欢思考噬菌体是如何度过这一天的，花时间和她的马在一起，想知道她的猫在想什么。在推特上找到她@JessicaSacher．
参考文献
1.等。"重新审视噬菌体治疗:旧资源的新应用"微生物学的趋势23.4(2015): 185 - 191。PubMedPMID: 25708933．
2.Cooper, Callum J.， Mohammadali Khan Mirzaei和Anders S. Nilsson。“为基于噬菌体的疗法调整药物批准途径。”微生物学前沿7(2016)。PubMedPMID: 27536293．公共医学中心PMCID: PMC4971087．
3.辛普森，大卫·J，杰西卡·c·萨彻和克里斯汀·m·西曼斯基。“探索噬菌体编码的聚糖结合蛋白和碳水化合物之间的相互作用。”结构生物学的最新观点34(2015): 69 - 77。PubMedPMID: 26275959．
2.韦格勒，彼得和伊丽莎白·a·罗利。细菌及其病毒修饰碱基的生物合成与功能化学评论(2016)．PubMedPMID: 27319741．
3.辛普森，大卫·J，杰西卡·c·萨彻和克里斯汀·m·西曼斯基。从噬菌体中鉴定受体结合蛋白的试验方法的发展病毒8.1(2016): 17。PubMedPMID: 26761028．公共医学中心PMCID: PMC4728577．
4.等。“用于功能基因组和宏基因组筛选的快速DNA文库构建”。应用与环境微生物学74.5(2008): 1649 - 1652。PubMedPMID: 18083885．公共医学中心PMCID: PMC2258639．
参考资料在Addgene博客188博金宝官网
- 了解CRISPR如何与噬菌体结合以达到抗菌目的
- 使用酵母双杂交系统探索蛋白质-蛋白质相互作用
- 使用CRISPR全基因组屏幕
在Addgene.org上的资源
主题:微生物学，分子生物学协议和提示，质粒
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