这篇文章由普罗梅加的凯尔·霍珀撰稿。
自从有质粒可以共享以来，研究人员就一直在共享质粒。回到我在实验室的时候，如果你读了一篇论文，看到一个你想使用的有趣的结构，你可以自己制作，也可以“通过电话克隆”.我的一位教授非常擅长与世界各地的实验室进行电话克隆，他有特定的策略和策略来获得他想要的质粒。Addgene使在实验室之间共享你的构建变得非常容易。普罗梅加支持Addgene使命声明:通过改进对有用研究材料和信息的访问，加快研究和发现。我们的许多技术平台像HaloTag®融合蛋白，密码子优化的萤火虫荧光素酶基因(例如，luc2),NanoLuc®荧光素酶可从存储库中获得。我们鼓励人们去Addgene获得新的创新工具。毕竟，当我们分享的时候，科学不是更好吗?
NanoLuc®荧光素酶-基于DNA的工具是可以加速你的研究的技术的极好例子。从一个相当单调的19kDa的DNA中创建NanoLuc®荧光素酶Oplophorus由Promega的先进技术小组开发的荧光素酶以及由Promega的化学小组开发的coelenterzine底物向更稳定更明亮的furimazine的进化是一个好故事(1.)从深海虾到紧凑的生物发光发电站，NLuc比我们更常见的荧光素酶如萤火虫（FLuc）和荧光素酶亮100倍雷尼利亚荧光素酶(RLuc)。重要的不是你反应的亮度，而是你反应的敏感度。NLuc从Fluc或RLuc反应中产生相同数量的光需要少100倍的蛋白质。事实上，NLuc足够明亮，可以检测通过CRISPR/Cas9敲入生成的内源性标记基因。最后，NLuc仅为19 kDa，非常适合内源性蛋白标记。一个例子是CRISPaint-NLuc结构(质粒#67178)用于Schmid Burgk，J.L.等人概述的系统(2.）.
在这篇文章中，我将介绍NLuc技术的两个重要应用。第一个将NLuc与荧光蛋白结合以制作更好的报告器，第二个将NLuc与荧光蛋白结合以制作更好的生物传感器。金宝搏app下载
NanoLuc®-用于成像的荧光蛋白融合
金宝搏app下载是非常好的成像工具，但使用有限体内因为它们必须由外部光源激发。这些外部光源可以产生自发荧光，并且由于被组织吸收而具有有限的穿透力。为了避免整个动物吸收含血红素的蛋白质，应使用600 nm或以上波长的光。
研究人员经常使用生物发光来克服这些问题，因为传统的荧光素酶发射的波长接近最佳波长(Fluc发射波长为610 nm)，不需要外部光源。不幸的是，检测传统的荧光素酶的微弱光发射需要很长的采集时间，这对于某些实验设置可能是不切实际的或不可行的。
NLuc的亮度引起了想要进行全动物成像的研究人员的注意，然而NLuc的发光峰在460 nm，因此对于活体成像不是最优的。
解决方法是将Nluc与红移氟耦合。在这里，NLuc内部通过一个被称为生物发光共振能量转移(BRET)的过程激发荧光。然后，荧光发出超过600纳米的穿透组织波长的光。
卢米氟
Schaub，F.X.等人(3.)设计了两个成像探头。一个由融合到增强型绿色荧光蛋白（GpNluc）的NLuc组成，另一个由融合到更具穿透性的橙色荧光蛋白融合（OgNLuc）的NLuc组成。这两种荧光蛋白都能被Nluc发射激发，实验室将这种融合称为LumiFluor Reporters。LumiFluor报告构建体被设计成包装成逆转录病毒，用于感染宿主细胞。使用BRET报告基因的荧光部分，通过流式细胞术对成功感染/表达的细胞进行分类。将分离的细胞注射到小鼠体金宝搏app下载内，并在i.p.或i.v.给药用于纳米Luc荧光素酶的呋喃嗪底物后成像。GpNLuc和OgNLuc BRET报告器在没有外源性激发的情况下都产生了明亮的信号，OgNLuc是最亮的，因为它的发射波长接近600 nm——这清楚地证明了为什么BRET报告器可以改善深部组织成像。GpNLuc和OgNLuc的结构可以通过Addgene (Cat.# .)获得70185和70186分别为）。
心宿二
Chu，J.等人(4.)，同样地，他们希望生产一种用于成像的BRET探针。这些作者着手设计一种更好的荧光蛋白，可以使用相同的激发波长与GFP共成像。结果是青色可激发橙色荧光蛋白CyOFP1。CyOFP1是从mNeptune2通过33个突变和2个缺失在分子上进化而来的。CyO与类似的橙色荧光蛋白相比，FP1具有更高的量子产率、亮度和更好的成熟时间。在他们的工作中，作者注意到CyOFP1如何被NanoLuc®荧光素酶（NLuc）激发，并着手通过将两个CyOFP1分子连接到NLuc（CyOFP1-NLuc-CyOFP1；Antares）来创建体内成像报告器.将Antares或萤火虫荧光素酶的质粒直接注射到小鼠肝脏，然后在24小时后静脉注射呋利嗪或荧光素，与该模型中的Fluc相比，显示出来自Antares的信号亮度高出2倍以上。金宝搏app下载心宿二的结构可通过Addgene（Cat#74279）.
增强Nano-Lanterns
铃木，K.等人(5.)使用荧光蛋白（FPs）在活细胞中同时成像多种蛋白质这可能是个问题，因为激发光会导致光毒性、自体荧光和干扰生物现象。将FPs与荧光金宝搏app下载素酶偶联的技术可以克服这些问题，但受到来自偶联荧光素酶的微弱信号的阻碍。该策略首次应用于RLuc8，这是一种工程技术雷尼利亚荧光素酶，用于产生一系列FP-RLuc8融合体，用于多色成像。在所有这些融合中，柯伦他嗪引发荧光信号，这些FP-RLuc8融合被称为纳米灯笼。
RLuc8比RLuc亮5.5倍，但NLuc比RLuc8亮30倍(6.）.因此，Susuki, K等人用NLuc取代了他们的纳米灯笼中的RLuc8部分，并将其称为增强的纳米灯笼。这些伟大的成像工具产生青色、黄色、绿色、橙色和红色荧光。本文报道了增强纳米灯的广泛应用，包括监测多个细胞事件，如亚细胞结构和基因表达的动态。你一定要看那些展示Ca的电影2+心肌细胞动力学。
增强型纳米灯笼结构可通过Addgene获得:绿松石(CeNL;质粒#85199)，黄色（YeNL；质粒）#85201)，橙色（OeNL；质粒）#85202)和红色(ReNL;质粒#85203)NLuc融合。这个长井实验室另外，它还将超过25个增强型纳米灯笼融合到其他细胞蛋白质上。
利用NanoLuc®荧光素酶的bret生物传感器
利用荧光共振能量转移技术已经制造出许多细胞内钙释放等事件的传感器(烦恼)探测器。这些探针通常由一种与两种荧光蛋白融合的反应蛋白（如钙结合蛋白）组成。当反应蛋白与钙结合时，它会改变构象，将两种荧光蛋白结合在一起，从而增加它们的FRET信号。FRET是从一个荧光蛋白到兼容荧光蛋白的非辐射能量金宝搏app下载转移。FRET可以通过激发最蓝移的荧光蛋白（供体）和测量该对中红移荧光蛋白（受体）的合成发射来测量。受体的发射越高，FRET信号越强。在设计良好的基于FRET的生物传感器中，FRET信号的强度可以与生物分子的特定浓度相关。
FRET传感器面临着光漂白、自体荧光以及激发青色可兴奋供体的光毒性等挑战。使用FRET传感器的另一个挑战是使用光生调节器启动被监测的事件。光生调节器对特定波长的光做出反应，从而启动信号传递。当FRET施主激发波长与光生起始波长重叠时，光生调节器的激发导致FRET传感器的虚假激活。
研究人员试图通过将荧光供体交换为生物发光供体，制造BRET探针来缓解其中的许多挑战。在这里，生物发光供体不受其他荧光探针激活的影响，但仍然可以将能量转移到荧光蛋白受体。NLuc是一种优秀的BRET供体，因为它的亮度发光。
细胞内钙传感器
杨，J.等人(7.)希望通过光遗传受体黑视素(melanopsin)触发细胞内Ca++的释放，需要短暂暴露在470nm蓝光下。为了避免与这种光基因工具重叠，他们需要创建具有以下特征的钙传感器:
- 无光激发
- 高离子特异性
- 高灵敏度
- 简单的表达
- 给比率计数据
结果是一种称为CalFlux VNT的融合蛋白。CalFlux VNT由Venus荧光蛋白、肌钙蛋白C Ca++结合域和NanoLuc®荧光素酶组成。CalFlux VNT对细胞内钙的变化作出反应，可用于细胞和脑外植体中事件的直接成像。这个结构可以通过Addgene(质粒#83926）.
活电池电压传感器
英加基及其同事(8.)我们感兴趣的是使用光激活、光生累计器去极化或超极化膜。传统的FRET报告器无法使用，因为所需的激发波长也会激活光生累积器。研究人员使用一个FRET报告器，并通过使用NanoLuc®荧光素酶结合一个插入膜的电压传感域（LOTUS V；用于电压通用传感的发光光学工具）激发维纳斯荧光蛋白，将其改编成BRET报告器。利用这种传感器，膜去极化增加BRET信号，而超极化降低信号。作者还演示了LotusV在许多模型系统中都可以工作。这个结构可以通过Addgene(质粒#87127).
将NanoLuc®荧光素酶与荧光蛋白配对，使研究人员能够使用其他荧金宝搏app下载光素酶无法使用的创新工具。在这些工具中，NanoLuc荧光蛋白融合将NLuc的亮蓝色发光转变为对细胞和细胞更友好的波长体内成像。NLuc还允许研究人员将FRET生物传感器转换为更多功能的BRET生物传感器，甚至可以与光遗传调节剂配对。这些工具中的许多都可以从Addgene获得，我们很高兴看到你如何在你的小组中利用它们!
非常感谢我们的客座博主凯尔·霍珀。
Kyle Hooper博士曾是一名技术服务科学家，也曾在研发部门从事产品开发工作，现在在Promega专门支持Promega细胞分析产品。
工具书类
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