我们中的许多人感到欣慰的是，这通常不是数量，而是数量质量这真的很重要。事实证明，使用AAV并非如此。当涉及到感染细胞时，滴度，病毒的使用量，确实很重要。（*psst*，质量当然也很重要）。
与细胞接触
尽管单个AAV颗粒感染细胞的能力取决于其衣壳结构及其感染的细胞，但让这些颗粒感染细胞也非常依赖滴度。为了让AAV粒子感染细胞，它必须与该细胞发生物理接触。由于每个电池上的表面积有限，因此获得与电池接触的更多AAV的方法是增加AAV浓度。
在这张流程图中，你可以看到AAV粒子的比例越来越小，它们通过细胞的每个部分到达细胞核，在那里它们的基因货物可以被表达。
底线是很多为了使一些好的AAV粒子进入细胞中产生表达，需要大量的AAV粒子。滴度越高越好。
AAV转运与转基因表达
很明显，我们需要高滴度，因为细胞和单个AAV粒子之间的接触是罕见的。但简单地进入细胞可能并不总是足够的，因此需要更高的滴度。例如,逆行AAV被运送到细胞的轴突上。虽然这种功能的机制尚未完全理解，但我们可以想象，这种传输可能不是100%有效。因此，进入细胞的少数AAV颗粒现在必须沿着轴突，穿过细胞，并可能扩散到更大的区域，因此需要更高的逆行AAV滴度才能成功转导。
在另一个例子中，顺行AAV的神经元基因表达随着滴度降低而急剧下降。如图2所示，来自5x10的表达式11滴度基本上不存在，因为没有足够的病毒产生任何可观察到的表达。将滴度加倍到1012导致了大约200个细胞的表达。增加滴度至1013导致了大约6倍的表达增加[3，图2]。请注意，随着滴度的增加，表达量呈指数增长。这意味着，一旦你下降到每个细胞的病毒颗粒的特定(非常高)阈值以下，你可能无法检测到aav介导的基因在靶细胞中的表达。
实际考虑
如果你有高质量的AAV，你可以通过集中你的病毒来解决低滴度的问题。看到我们的集中AAV协议(步骤10)了解如何做到这一点。浓缩病毒可以让您在使用与实验设置兼容的体积的同时，向溶液中添加更多的病毒颗粒。
有些实验要求更高的基因表达，因此比其他实验要求更高的滴度。例如，荧光蛋白的可视化表达通常需要高滴度，因为许多病毒颗粒必须感染细胞才能实现蛋白质的可视化表达。金宝搏app下载然而，在你的实验中，受体的表达可能不需要那么高来获得可观察的信号，因此在用AAV传递受体结构物时，滴度可能不需要那么高。在通道视紫红质情况下，被转导细胞变得对光敏感所需的通道蛋白比获得良好荧光信号所需的荧光蛋白要少。金宝搏app下载在寻找有效的基因表达时，可能没有必要将这种类型的载体浓缩到如此高的滴度。
首先你是如何达到高滴度的?
一些AAV已知难以以高滴度生产。其中包括AAV2，已知其粘附于细胞内部，导致释放到悬浮液中的颗粒减少，并降低可从周围培养基中获取的病毒颗粒数量。
尽管如此，您可以通过多种方式优化AAV生产。我们在下面列出了一些您可以采取的简单步骤，但您应该阅读我们的AAV生产协议参阅其他最佳实践。
- 让你的细胞快乐——确保你的细胞尽可能健康，为产生病毒粒子的艰难过程做好准备。
- 限制试管转移-病毒颗粒粘附试管的机会越少，滴度就越高。如果可能，使用低结合管或硅化管储存样本，因为病毒颗粒更难粘附在这些管上。
- 冲洗过滤器-使用浓缩过滤柱时，确保用周围溶液冲洗过滤膜表面，以确保多余的病毒颗粒不会粘附在膜上。
- 稀释时要小心——如果你的AAV浓度超过了你想要的效价，要稀释它，在向溶液中添加缓冲液时要谨慎。添加的缓冲液要比你想要达到的精确浓度少一点，以避免过度稀释，并确保在稀释后重新测量滴定度来确认。
卢克·马卡纳·汉利(Luke Makana Hanley)是Addgene研究团队的实验室技术人员，致力于提高AAV产量的方法。
工具书类
1.克拉克,k·里德。重组腺相关病毒载体生产的最新进展肾脏国际61.1 (2002): S9-S15。PubMedPMID:11841606．
2.舒尔茨，张伯伦JS。重组腺相关病毒的转导和整合。分子治疗 : 美国基因治疗学会杂志。2008;16(7):1189-1199. 内政部：10.1038/mt.2008.103。PubMedPMID:18500252．公共医学中心PMCID:PMC2574934．
3.AAV介导的顺行跨突触标记：绘制皮质球输入定义的防御行为神经通路神经元93.1(2017): 33-47。PubMedPMID: 27989459．公共医学中心PMCID:PMC5538794．
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