NGS质粒验证背后的动力:seqWell

客人的博客

Guest Blogger.2017年4月19日

本文由客座博主Joe Mellor贡献，他是seqWell公司。

质粒和PCR产物是世界上的分子生物学实验室的面包和黄油。科学家传统上使用了Sanger测序来验证这些结构，因为桑格测序相对较低的成本和快速的周转时间历来符合大多数分子生物学实验室的需求。近年来，技术的快速进步，允许大规模创造和合成更长的合成DNA片段(“写”)，以及极其快速、廉价和准确的DNA测序(“读”)的出现，已经改变了我们对许多实验室项目的可行规模和范围的集体思考。然而，高通量下一代(NGS)测序样品制备的高成本使实验室无法将这些方法用于质粒验证等常规过程。

在SEQWELL，INC。，我们的使命是通过开发通过提高图书馆准备的效率和简洁来帮助解锁现代测序仪器的潜力的技术来克服NGS的至关重要挑战。作为我们使命的一部分，我们一直在与Addgene合作开发和应用我们的Plexwell™基于ngs测序和确认Addgene从世界各地收集的大量和不断增长的质粒的文库制备技术。本文的其余部分将更详细地描述plexWell™，以及我们如何与Addgene合作使用这种技术对大量质粒进行测序。

plexWell™技术概述

对于任何一个总会在在实验中，被测序的DNA样本必须被剪成更小的片段，然后进行条形码识别。这种条形码片段的混合物被称为“库”。在文库中对片段进行平行测序，使研究人员能够重建完整的个体序列。传统的NGS工作流程受到昂贵的库准备的限制，因为每个示例都需要一个单独的库。

plexWell™工作流程是一个连续的“汇集库准备”，在此过程中，相对大量的样品经过DNA条形码步骤，从96孔板的每个孔中唯一地标记DNA。然后，将来自几个盘子的样本汇集在一起，创建一个包含带有特定样本条形码的碎片的库。plexWell™不再继续单独处理100到1000秒的样品，而是在第一步标记后，将每96孔板减少到一个管。plexWell™序列标记程序的另一个好处是，每个样本的文库分子数量在广泛的输入DNA浓度范围内保持高度标准化。这个过程在动画中有更充分的解释图。1在下面。

归一化是多重NGS图书馆准备中的基本且经常低估的问题。这里的挑战是，随着更多样本同时测序，它变得越来越难以获得所有样本的平衡和充分覆盖。归一化问题的根源通常来自大量单独的输入DNA样本（如。板上的96个质粒的集合通常具有广泛的输入量。这种变化对于常规的NGS库预备方法是有问题的，因为个体文库的产量或质量可能受输入样本的数量或质量的影响。

为了尽量减少这些问题，研究人员通常包括一个单独的正常化在进行图书馆准备之前，单独输入DNA样品在彼此中均匀地呈线的步骤。即使是这种“预准备”的正常化，也通常是从多个样本中制备的个体文库的情况也将也需要被量化和重新归一化，以便在一个单一的多路复用池中与其他样品结合。这些标准化步骤的成本(以时间和消耗品衡量)对于大量的样品来说可能是令人生畏的。

如上所述，Plexwell™的主要技术益处之一是标准化文库是由大量具有宽范围的输入浓度（通过专有化学）的样品产生的标准化文库。这对于获得足够的测序深度和覆盖来说，这对例如从单一的illuminamiseq®运行组装数百种不同的质粒来说至关重要。如图所示图2， 100倍范围内(1ng - 100ng)的输入浓度差异归一化为高于和低于每个样本的平均读计数的两倍变化，和每个读数的信息量不会因DNA输入量而变化。 SEQWELL归一化

plexWell™+ Addgene =高质量的ngs组装质粒

由于在样本之间读取计数和片段长度的规范化增强，通过plexWell™库获得的NGS数据非常适合大规模使用德诺维短构造物等质粒的组装。Plexwell™工作流还提供了一种高效的基于NGS的替代品，因为样品标识信息总是在各个读取级别显示，并且由于定制引物或“引物步行”反应完全不需要测序多kB DNA插入和更大的目标。NGS读数还揭示了有关存在于原始样品中存在的非质粒DNA或异质和/或混合克隆的其他信息。

在Seqwell，我们有与Addgene合作开发高度优化的生物信息学管道，将从Plexwell™NGS数据中返回高质量的组装和圆形质粒。一旦加入生产质粒DNA的板，它们就会运到SEQWELL，在那里它们被制备为Plexwell™文库，在Illuminaβ序列仪上测序，然后用我们的质粒组装管道分析。迄今为止，这导致了高质量的基于NGS的组件，适用于超过3000多种质粒Addgene集合。

测序工作流程