我实验室的选择的载体是AAV，几乎每个实验都需要AAV。在加入我的实验室之前，我从来没有接触过AAV，所以自然我必须为我的第一次实验包装一些病毒。这有点吓人，但我有实验室的协议和一些很棒的同事帮我。即使有了这些工具，我还是发现自己在协议的空白处写了AAV制作技巧。虽然这些提示对实验来说并不重要，但它们绝对让我的生活更轻松!在这篇文章中，我将分享一些AAV生产，净化,滴定法同时也总结了包装AAV所需的基本步骤和分析。
AAV生产
概述:包装AAV的第一步是用AAV包装质粒转染HEK293细胞。细胞需要三种不同的质粒来产生AAV: 1) RepCap质粒，它提供AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。AAV复制使用宿主的聚合酶，但需要Rep蛋白，将双链中间产物加工成单链基因组，然后包装到AAV的蛋白壳或衣壳中;2)表达腺病毒基因的pHelper质粒，介导AAV病毒复制;3)转移质粒，它编码打包到病毒中的转基因。转染后2 - 5天，收集和纯化含aav的细胞和培养基。总的来说，这个过程需要4-7天，这还不包括扩展HEK293细胞所需的时间。检查Addgene AAV生产方案为更多的细节。
专业技巧
- 我不打算撒谎，AAV转移质粒是一种痛苦的工作。这些质粒包含AAV适当包装所必需的itr，但也形成二级结构，易于从转移质粒中删除。好消息是，有一些简单的方法可以解决这个问题。一种方法是在30°C而不是37°C培养AAV转移质粒的多种细菌培养物，然后筛选ITR重组SmaI或XmaI限制性内切酶消化(itr包含smi和XmaI限制性内切位点)。另一种方法是将AAV转移质粒转化成细菌菌株，比如内稳定．稳定的感受态细胞缺乏RecA，一种帮助复制区域(如itr)进行同源重组的蛋白质。对ITR缺失的限制性消化筛查仍然是必要的。
- 为了节省时间和金钱，我喜欢用5ml的AAV转移质粒进行微型准备，然后用smi酶切物进行筛选。我将剩余培养物的细菌颗粒冷冻，然后只对完整itr的培养物进行最大限度的培养。
- 我使用类似的电子表格这一个计划我的AAV包装PEI转染。它为我节省了时间，帮助我弄清楚我是否有足够的质粒来完成我的实验。
- AAV通常是我实验的限制试剂，所以我总是制作比我认为需要的更多的AAV。与慢病毒不同的是,AAV需要更多的病毒颗粒用于高效的基因转移。我觉得多一点AAV比生产更多病毒要好因为我没有足够的AAV。
- 与Addgene AAV生产协议相比，我采取了一种更懒惰的方法来收获我的AAV。我跳过了HEK293细胞培养上清的PEG沉淀，因为准备40% PEG溶液非常耗时。PEG在加热的搅拌板上需要几个小时才能溶解，并需要监控，以确保溶液不会太热，因为那样的话PEG会分裂成两个阶段。如果发生这种情况，溶液就会被冷却，两相就会混合在一起。最后，PEG溶液需要消毒，要么通过过滤，这需要时间，因为溶液是粘性的，要么通过高压灭菌，这也需要时间。我选择只收获细胞颗粒，而不是把所有这些努力投资在准备试剂上。如果我使用PEG沉淀，我的产量会更高，但在我的实验中，我从细胞颗粒中获得了足够的病毒。如果产量很重要，或者如果您正在研究的AAV血清型的病毒颗粒主要在培养基中发现，您应该考虑进行PEG沉淀。
- 我用这个来裂解细胞，而不是用超声波来裂解细胞AAV裂解缓冲然后在95%乙醇和干冰浴中冷冻/解冻溶解态四次，以释放细胞中的病毒粒子。在碘醇纯化之前，细胞裂解液立即用苯并酶处理。这种方法给了我一点灵活性，因为我可以在净化AAV之前在-80°C下储存细胞裂解液长达6个月(Choi等人)。
碘二醇梯度超滤纯化AAV
概述:碘二醇梯度超离心使用不同浓度的碘二醇梯度从不纯的AAV制剂中分离出污染物。将15%、25%、40%和60%的碘沙醇溶液小心地分层，然后将AAV生产过程中产生的病毒悬浮液覆盖。在超离心后，收集含有40% aav的馏分，交换缓冲液以去除碘二醇并浓缩纯化病毒。这个过程可以在漫长的一天内完成，也可以将病毒储存在4°C，并在第二天交换缓冲液。指的是碘二醇梯度超离心法为更多的细节。
专业技巧
- 看这个AAV净化视频！当我第一次进行碘二醇梯度净化时，它还不存在，但我希望它存在。该视频简要介绍了碘沙醇净化工作原理，展示了如何创建碘沙醇梯度层，并有一些伟大的指针，同时帮助您掌握碘沙醇AAV净化。
- 如果你是创建梯度的新手，在第一次净化之前练习做碘二醇层。这帮助我对碘沙醇溶液的分层有了一种感觉，并让我再次检查碘沙醇梯度溶液的制备是否正确。
- 当引用纯化的和缓冲交换的病毒时，记得做一个或两个小的等价物用于qPCR滴度。这有助于避免多次冻结/解冻您的较大等量的病毒。
qPCR法测定AAV
概述:AAV滴度通过qPCR量化AAV prep中包含基因组的病毒颗粒的数量。AAV样本首先被dnase酶切，以去除从AAV生产过程中携带的任何残留的AAV质粒。无论是SYBR绿色技术或TaqMan引物/探针集都可以使用，样品通过比较AAV标准曲线进行定量，该标准曲线是由含有itr的质粒生成的。整个过程大约需要3小时完成:1小时的动手时间和2小时的qPCR运行和数据分析。指的是这个qPCR法测定加基因AAV为更多的细节。
专业技巧
- 当计算你的AAV效价时，记住要考虑到dnase消化样品的稀释。
- 在处理AAV质粒标准品和AAV转移质粒时，要使用良好的无菌技术。工作空间很容易被质粒污染，但我并不知道这一点……应该始终包含无模板控制(NTC)。
- 虽然qPCR产生的物理滴度是有用的，但我测试了几种不同浓度的病毒，或多重感染(MOIs)，以确定我感兴趣的细胞的最佳AAV剂量。每一批AAV都需要自己的MOI优化来考虑批与批之间的可变性。看看这篇文章了解更多关于滴度AAV的不同方法。
你有什么AAV制作技巧或窍门吗?请在下面的评论中分享!
特别感谢弗雷德·哈钦森癌症中心的Dan Stone博士和Harshana de Silva Feelixge教授我AAV的生产和净化!
参考文献
1.aunhammer, C.， Haase, M.， Muether, N.， Hausl, m.a.， Rauschhuber, c.t.， Huber, I.， Nitschko, h.m.， Busch, U.， Sing, a.s.， Ehrhardt, A.， & Baiker, A.(2012)。通用实时PCR检测和定量腺相关病毒血清2型反向末端重复序列人类基因治疗方法23, 18-28。PubMedPMID:22428977．
2.崔，V.W.， Asokan, A.， Haberman, r.a.， & Samulski, R.J.(2007)。体外和体内使用的重组腺相关病毒载体的生产。188完整比分直播《当前分子生物学协议》，第16章16.25、单位。PubMedPMID:18265393．
Addgene博客上的其他资源188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
留下你的评论